钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶的结构和功能

钙 /钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶 (calcium/calmodulin dependentserineproteinkinase,CASK)属于膜相关鸟苷酸激酶 (membraneassociatedguanylatekinase ,MAGUK)家族 .CASK具有多个不同蛋白质结合结构域 ,在细胞膜的特定区域 ,与其他蛋白质形成多种蛋白质复合体 ,参与组成细胞骨架 .它通过衔接细胞外信号蛋白和细胞内骨架蛋白 ,协助功能蛋白质的转运和定位 ,以及细胞内的信号传递 .此外CASK还可以进入细胞核影响基因转录调控 ,以及作用在神经突触膜上参与神经递质的释放 .

血管性痴呆大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸-2B亚基受体水平和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ活性以及美金刚干预作用的研究

目的研究血管性痴呆(VD)大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸-2B亚基受体(NR2B)水平和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性的变化以及美金刚的干预作用。方法采用结扎双侧颈总动脉方法制备VD大鼠模型,随机分为VD模型组(VD组)和美金刚治疗组(美金刚组)。于术后4周、8周、12周、16周用Morris水迷宫试验检测VD组和美金刚组大鼠的学习记忆水平,用RT-PCR法检测大鼠海马NR2B水平,用32P掺入法检测大鼠海马CaMKⅡ的活性;并与假手术组比较。结果与假手术组比较,VD组大鼠术后各时间点的学习记忆能力均显著下降(均P<0.01);海马NR2B的水平术后4周时明显增高(P<0.05),术后8～16周显著降低(均P<0.01);海马总CaMKⅡ活性术后4周时明显增高(P<0.01),术后8周下降,术后12周、16周明显降低(均P<0.01)。美金刚组术后4周时上述3项检测结果与VD组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01),而与假手术组比较,差异均无统计学意义;在其他时间点,与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05～0.01);学习记忆水平和NR2B水平术后8周、12周明显高于VD组(P<0.01～0.05);总CaMKⅡ活性与VD组比较,差异无统计学意义。结论VD大鼠海马NR2B水平和总CaMKⅡ活性降低;美金刚能上调海马NR2B表达及改善VD大鼠的认知功能,但对CaMKⅡ活性的影响有限。

葡萄类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶VvCIPK10的特性与表达

【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶Vv CIPK10,分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式,为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能,探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得Vv CIPK10序列,设计特异引物进行RT-PCR反应,对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析;构建原核表达载体,转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达,收集菌体后裂解细胞,制备蛋白上样液,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,同时对融合蛋白进行可溶性分析;IPTG大量诱导表达融合蛋白,收集菌体后进行超声破碎细胞,用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-Vv CIPK10融合蛋白,SDS-PAGE电泳进行分析;纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应,反应后SDS-PAGE电泳,压磷屏检测体外自磷酸化反应;构建重组瞬时表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10;分离拟南芥原生质体,通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至原生质体;通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至洋葱表皮细胞,培养16 h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测;选择生长相对一致且健壮的葡萄植株,于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样,同时在田间取葡萄不同组织样品,实时荧光定量PCR检测Vv CIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式。【结果】PCR克隆获得葡萄Vv CIPK10全长为1 357 bp,5′端非编码区为30 bp,3′端非编码区为156 bp,开放阅读框为1 171 bp,编码436个氨基酸,理论等电点为8.59,分子量为48.7 k Da。保守结构域预测分析显示该蛋白5′端具有一个激酶结构域,3′末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域。BLSATP分析表明葡萄Vv CIPK10与桃树CIPK(XP_007205151)一致性最高(74%)。重组表达载体p MAL-C5X/Vv CIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量(43 k Da+48.7 k Da)相一致的融合蛋白。MBP-Vv CIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,Vv CIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn^(2+),不依赖于Mg^(2+)和Ca^(2+),EDTA可以抑制Vv CIPK10的自磷酸化活性。亚细胞定位结果显示,Vv CIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质。Vv CIPK10在葡萄各个组织中均有表达,主要在葡萄根和叶片中大量表达,葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低。在干旱、低温和盐胁迫处理后,Vv CIPK10呈现受诱导表达模式。Vv CIPK10的表达在低温胁迫后6 h达到峰值,干旱和盐胁迫后2 h即达到峰值。【结论】葡萄Vv CIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫,推测Vv CIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅡδRNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响

目的研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ(Ca2+/Calmodulin dependent kinaseⅡδ,Ca MKⅡδ)RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响,以证实其在破骨细胞分化中的作用。方法应用慢病毒构建Ca MKⅡδRNA干扰载体,并确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值及转染效率。小鼠RAW264.7细胞分为对照组、空白载体组和干扰组。转染5 d后收获细胞,确定干扰效率;并检测RNA干扰对活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、非受体酪氨酸激酶(c-Src)基因表达及破骨细胞分化的影响。结果成功构建了Ca MKⅡδRNA干扰载体,最佳转染MOI值为30,转染效率可达78%(P<0.05)。重组病毒对Ca MKⅡδ的干扰效率在mRNA水平超过78%,在蛋白水平超过70%(P<0.01)。Ca MKⅡδRNA干扰显著降低NFATc1、TRAP和c-Src基因,与对照组、空白载体组比较,其mRNA水平下降分别超过了47.8%、43.3%和48.5%(P<0.05,P<0.01),蛋白相对水平分别超过了61.1%、48.2%和39.6%%(P<0.01);免疫荧光细胞化学检测也得到相似结果。Ca MKⅡδRNA干扰也显著降低了破骨细胞生成及骨吸收功能;与其他两组比较,干扰组破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数目和面积下降分别超过了49.8%、47.6%和61.3%(P<0.01)。结论 Ca MKⅡδRNA干扰可显著下调其下游NFATc1、TRAP、c-Src基因表达并抑制破骨细胞分化;Ca MKⅡδ在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用。

缺氧对钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶表达的影响及其与p38 MAPK信号通路活化的关系

目的探讨缺氧对钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK）表达的影响及其与p38MAPK信号通路活化的关系。方法采用定量PCR方法Western blot技术，检测内皮细胞株的CASK在常氧和缺氧1、3、6、12h条件下表达情况。采用Western blot技术，检测常氧和缺氧1、3、6、12h条件下p38 MAPK 180位苏氨酸／182位酪氨酸双位点磷酸化情况，及p38信号通路特异性阻断剂SB203580预处理1h，血管内皮细胞缺氧3h后CASK蛋白的表达。采用双荧光素酶报告系统，分析常氧和缺氧1、3、6．12h条件下CASK启动子报告基因的活性。结果缺氧能够明显上调CASK mRNA和蛋白的表达，缺氧3h，CASK mRNA的表达为常氧对照组的1．8倍，CASK蛋白表达为常氧对照组的1．4倍。p38MAPK信号通路阻断剂SB203580预处理，能够以剂量依赖性方式抑制3h缺氧诱导的内皮细胞CASK蛋白表达。不同时间的缺氧能够明显增强CASK荧光素酶报告基因的活性。结论缺氧能够诱导内皮细胞CASK的表达部分依赖于p38MAPK信号的活化。

c-Jun氨基末端激酶信号通路对缺氧上调血管内皮细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶表达的影响

目的了解缺氧对钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)表达的影响及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在其中的作用。方法将人血管内皮细胞株EA.hy926进行缺氧处理3 h后继续常规培养0、12、24、48、72 h,同时设常氧培养对照。采用蛋白质印迹法检测CASK的表达。构建CASK启动子区荧光素酶报告基因质粒。用其转染细胞后,于常氧及缺氧培养1、3、6、12 h裂解细胞提取总蛋白,检测报告基因萤火虫荧光素酶及内参照海肾素荧光素酶活性,并用蛋白质印迹法检测JNK磷酸化情况。在培养的细胞中分别加入不同剂量(0、10、100 nmol/L,1、10μmol/L)的JNK抑制剂SP600125预处理1 h后再缺氧培养3 h,观察其对CASK表达的影响。结果缺氧处理后常规培养0～72 h,细胞CASK持续保持高表达,并明显高于常氧组。随着缺氧时间延长荧光素酶相对活性普遍增加,均高于常氧组(0.010±0.003,P<0.01),且缺氧12 h达峰值(0.192±0.023)。JNK的磷酸化随缺氧时间延长逐渐增强。加入SP600125后,CASK的表达显著降低,并呈剂量-效应依赖性,其浓度为10μmol/L时,抑制效率达高峰。结论缺氧上调血管内皮细胞CASK的表达部分依赖于JNK信号通路活化。

人瘢痕组织中钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶的表达

1对象与方法 1．1主要试剂和仪器兔 抗人钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK）多克隆抗体、兔抗人B肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体、增强型化学发光（ECL）试剂盒（美国Santa Cruz公司），二辛丁酸试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），聚偏二氟乙烯膜（美国Millipore公司）。酶标仪（奥地利Anthosht公司），电泳仪、凝胶成像仪（美国BioRad公司）。

钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶在胰岛素囊泡分泌过程中的作用

目的探讨钙／钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（CASK）在胰岛素囊泡分泌过程中的作用。方法体外培养胰岛B细胞株INS-1细胞，干扰或过表达CASK同时结合腺甘酸环化酶激动剂forskolin或硝苯地平处理，使用电镜观察干扰CASK后胰岛素囊泡的锚定情况和数量。两组问比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。结果（1）干扰CASK后，forskolin促胰岛素分泌的效应减弱[（4．5±0．4）%比（2．7±0．6）％，t=6．019，P〈0．01]。（2）过表达CASK不能逆转硝苯地平处理后引起的胰岛素分泌下降[（1．4±0．1）％比（1．5±0．3）％，t=0．40，P〉0．05]。（3）干扰CASK后胰岛素囊泡在细胞膜上的锚定明显减少，而总胰岛素囊泡数量组间差异无统计学意义[（140±30）比（123±45）个，t=0．44，P〉0．05]。结论CASK参与forskolin促胰岛素分泌的过程，其作用环节可能位于钙离子通道的下游；CASK很可能参与了胰岛素囊泡分泌的锚定过程。

钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶在胚胎发育及相关疾病中的作用

钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin dependent serine protein kinase,CASK）属于膜相关鸟苷酸激酶家族,有多种转录本.其表达具有明显的时空特异性,在胚胎期及成年组织中的分布明显不同,可通过翻译后修饰维持其活性.可被CDK 5和PKA磷酸化;可通过与SUMO1结合而受到SUMO化修饰调节.CASK在神经、精子、肾脏发育过程中均发挥着重要作用,与组织器官功能的实现密不可分,其功能异常可能导致相关疾病的发生.CASK可影响神经突触的形成与功能,基因突变可造成多种神经发育异常;参与精子发育成熟、精子的顶体反应,协助受精发生;CASK单独对肾脏发育无明显影响,它可以通过与DLG1相互作用而影响肾脏发育.

脊髓钙／钙调蛋白依赖性蛋白激酶II—NR2B信号通路参与小鼠骨癌痛的形成

目的探讨鞘内注射钙／钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）抑制剂KN93对骨癌痛小鼠脊髓NR2B蛋白表达的影响及机制。方法SPF级雄性C3J／HeJ小鼠36只，采用随机数字表法分为3组：假手术组（S组n=8）、骨癌痛组（BP组n=8）和KN93组（K组n=20）。BP组和K组采用股骨远端骨髓腔注射20μl含NCTC2472纤维肉瘤细胞的α—MEM的方法制备骨癌痛模型，S组骨髓腔注入不含NCTC2472细胞的同体积α—MEM。K组于接种肿瘤细胞后14d鞘内注射溶于20％DMSO的KN9360nmol／5μl，BP组和S组鞘内注射20％DMSO5μl。分别于肿瘤细胞接种前1d、鞘内注射KN93或溶媒前1h、注射后1，2，4，24h（T0-5）时各组随机取8只小鼠，采用vonFrey丝测定机械痛阈，并于各时点随机取3只小鼠处死取脊髓L3～5节段，采用Westernblot法测定NR2B蛋白的表达。结果与s组[机械痛阈（1．78±0．31）g、NR2B（0．33±0．04）]相比，除K组1r3时机械痛阈差异无统计学意义（P〉0．05）外，BP组[（0．50±0．11）g]和K组[（0．52±0．10）g]机械痛阈均降低（P〈0．05），BP组（1．78±0．34）和K组T2～5[分别为（1．11±0．14）、（0．73±0．03）、（1．11±0．15）、（1．89±0．32）]脊髓组织NR2B蛋白表达均上调（P〈0．05）；与BP组相比，K组T2～4机械痛阈升高，NR2B蛋白表达下调；与给药前T1相比，除K组T2～4机械痛阈升高外，各组各时点该指标差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论鞘内注射KN93缓解小鼠骨癌痛的同时降低小鼠脊髓NR2B蛋白表达，CaMKII—NR2B信号通路可能参与了骨癌痛的形成。

抑郁症患者外周血miRNA-219和钙调蛋白激酶Ⅱγ亚基mRNA表达水平的临床意义

目的通过检测首次发病抑郁症患者外周血中miRNA-219和钙调蛋白激酶Ⅱγ亚基mRNA(γCaMKⅡ mRNA)表达水平,分析探讨其与抑郁症之间的关系。方法纳入符合DSM-5中抑郁发作诊断标准的41例抑郁症患者(抑郁组)和31名健康对照者(对照组),采用HAMD17评估患者的抑郁症状严重程度,采集受试者空腹外周血样本,采用实时荧光定量PCR法检测外周血白细胞中miRNA-219表达水平和γCaMKⅡ mRNA表达水平,采用t检验进行组间比较;miRNA-219表达水平、γCaMKⅡ mRNA表达水平、HAMD17评分两两之间相关性采用Pearson相关分析。结果抑郁组外周血白细胞miRNA-219表达水平低于对照组(0.91±0.21与1.80±0.24,t=2.753,P=0.007 5),γCaMKⅡ mRNA表达水平高于对照组(5.55±0.57与2.16±0.20,t=4.970,P<0.01),差异均有统计学意义。并且抑郁组外周血白细胞γCaMKⅡ mRNA表达水平与HAMD17评分呈正相关(r=0.460,P=0.002 5)。结论抑郁症患者外周血miRNA-219表达水平降低,γCaMKⅡ mRNA表达水平升高,提示miRNA-219和γCaMKⅡ表达水平可能与抑郁症发病机制存在一定联系。

精氨酸加压素对大鼠视前区GABA_A受体亚单位磷酸化的影响

目的:研究精氨酸加压素(AVP)对大鼠视前区γ-氨基丁酸(GABA)A型受体(GABA_A受体)亚单位(α、β和γ2)表达和磷酸化的影响。方法:实验分为对照组、AVP组、V1a受体抑制剂+AVP组和V1a受体抑制剂组(均n=10);腹腔注射AVP或V1a受体抑制剂0.5 h后,采用RT-qPCR和Western blot法检测视前区GABA_A受体亚单位(α、β和γ2)表达及磷酸化的变化。结果:与对照组相比,AVP或V1a受体抑制剂组大鼠视前区GABA_A受体亚单位表达均无显著变化;AVP能显著上调视前区GABA_A受体γ2亚单位的磷酸化水平(P<0.05);AVP显著增加蛋白激酶C(PKC)和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达和磷酸化(P<0.01)。结论:外源性AVP不影响GABA_A受体亚单位(α、β和γ2)表达,但主要通过V1a受体激活PKC和CaMKⅡ,影响γ2亚单位磷酸化水平,从而调制视前区GABA_A受体介导的抑制性突触传递。

CASK下调表达对人血管内皮细胞ECV-304增殖能力的影响

目的建立CASK下调表达细胞株,研究钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium,calmodulin-associated serine/threonine kinase,CASK)下调表达对ECV-304细胞增殖能力的影响。方法将包含针对CASK基因干扰siRNA片段的pGenesil-1-hCASK重组质粒转染人ECV-304细胞株,经G418加压筛选,成功筛选出CASK下调表达的细胞株。用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中CASK基因的表达水平。采用流式细胞技术、MTT法观察CASK下调表达对ECV-304细胞增殖能力的变化。结果成功筛选出CASK下调表达ECV-304细胞株(siCASK细胞株),这些细胞在传代过程中绿色荧光蛋白能维持表达,细胞株中转染阳性率在90%以上;经蛋白免疫印迹法检测CASK表达明显降低;siCASK细胞株中G0/G1细胞比率下降,G2M期细胞比率明显上升,增殖指数明显提高,生长曲线左移。结论成功建立了CASK下调表达的ECV-304细胞株,CASK下调表达可导致细胞增殖能力增强。

缺氧对ECV-304细胞CASK表达及细胞内分布的影响

目的了解缺氧后ECV-304细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK)蛋白表达及细胞内分布的变化。方法将培养的ECV-304细胞置于缺氧(5%O2)条件培养1、3、6、12h,用Western blot方法检测CASK表达的变化,用免疫组化技术观察CASK在细胞内分布情况。结果ECV-304细胞的CASK表达随缺氧时间延长而逐渐增高,3h开始增加,6h达高峰,12h下降但仍高于正常。免疫组织化学染色的结果显示,随着缺氧时间的延长,细胞染色加深、并出现CASK向核膜聚集的现象。结论缺氧可以影响CASK的蛋白表达和细胞内分布,提示CASK可能是一个新的值得关注的缺氧相关蛋白。

siCASK重组载体构建及效应检测

目的 构建针对人CASK基因的siRNA质粒 ,建立CASK下调表达的细胞模型 ,为CASK相关的细胞信号研究奠定基础。方法 选择人CASK基因不同靶点 ,体外合成DNA模板 ,经退火后插入到pSilencer3 .1hygro载体的多克隆位点。阳性重组质粒转染ECV3 0 4细胞 ,蛋白印迹。观察siCASK对目的蛋白表达的抑制效率。结果 酶切、测序表明以pSi lencer3 .1hygro为载体的重组质粒siCASK构建成功。siCASK转染细胞后 ,能够明显抑制目的蛋白的表达。结论 成功构建了siRNA重组质粒 ,为下一步CASK功能研究奠定基础。

CASK在血管内皮细胞缺氧应激增殖反应中的作用

目的建立钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK)剔降血管内皮细胞株,初步探讨其对短暂缺氧的反应性。方法采用RNAi技术和脂质体介导的细胞转染技术,建立CASK表达下调的血管内皮细胞株,并观察缺氧应激条件下培养0(常氧)、1、3、6、12h细胞增殖指数的变化。结果血管内皮细胞在短暂缺氧后细胞增殖指数升高(常氧:42.93%,1h:50.46%,3h:52.53%),随着缺氧时间延长增殖指数则低于常氧对照组(6h:40.71%,12h:25.18%)。而CASK剔降血管内皮细胞株,在1～12h缺氧应激时限内,其增殖指数无明显变化。结论 CASK剔降内皮细胞株与对照EA.hy926细胞比较,对短暂缺氧应激的增殖反应性减弱。

过表达CASK基因对非小细胞肺癌H1299细胞凋亡及周期的影响

目的:探讨过表达人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)基因对非小细胞肺癌(NSCLC)H1299细胞凋亡及周期的影响。方法:将本课题组前期构建的CASK基因过表达慢病毒感染经体外培养的NSCLC H1299细胞(OE组),同时以CON328阴性对照病毒感染H1299细胞(NC组),并设空白对照组(MOCK组)。流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况及细胞周期变化。结果:OE组与NC组及MOCK组比较,细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。而NC组凋亡率与MOCK组比较,差异无统计学意义(P>0.05);与NC组和MOCK组比较,OE组G1期细胞数显著增多,而S期和G2/M期细胞数显著减少(P<0.05)。结论:CASK基因过表达可以显著升高NSCLC H1299细胞凋亡率,细胞周期停滞,细胞增殖缓慢,进而抑制肺癌的发展。

PPARγ激动剂罗格列酮对胰岛β细胞中CASK基因表达的影响

目的:探讨过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)γ激动剂罗格列酮对钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)的影响,探索CASK是否参与罗格列酮对胰岛素分泌的调控作用。方法:用不同浓度罗格列酮处理胰岛β细胞系INS-1细胞检测氯化钾刺激胰岛素分泌(KSIS);用不同浓度及时间罗格列酮处理INS-1细胞,检测CASK的mRNA、蛋白及定位变化;观察干扰CASK后罗格列酮对KSIS的影响情况。结果:罗格列酮处理后INS-1细胞的KSIS功能明显增强(P<0.05);不同浓度及时间罗格列酮处理INS-1细胞后CASK的mRNA和蛋白水平呈剂量及时间依赖性增加(P<0.05);干扰CASK后罗格列酮对KSIS的影响差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PPARγ激动剂罗格列酮上调INS-1细胞CASK基因的表达,但CASK并不参与罗格列酮对胰岛分泌的调控作用。

CaMKⅡ对多囊卵巢综合征模型小鼠颗粒细胞中Caspase-3表达的影响

目的:探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在正常小鼠卵巢和多囊卵巢综合征(PCOS)小鼠卵巢组织中的差异表达,阐明CaMKⅡ对PCOS小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法:用蓖麻油溶解脱氢表雄酮(DHEA)皮下注射诱导PCOS小鼠模型(PCOS组),对照组小鼠注射等体积蓖麻油,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测2组小鼠血清中睾酮水平,阴道涂片监测2组小鼠发情周期变化,HE染色观察2组小鼠卵巢组织病理形态表现,免疫荧光染色法检测2组小鼠卵巢组织中CaMKⅡ蛋白定位和荧光强度,Western blotting法检测2组小鼠卵巢组织中CaMKⅡ和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (Caspase-3)蛋白表达水平。采用短发夹RNA (sh-RNA)-CaMKⅡ慢病毒转染人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)建立稳转体系,分为空白对照组、 sh-CaMKⅡ-1组和sh-CaMKⅡ-2组,Western blotting法检测各组KGN细胞中CaMKⅡ和Caspase-3蛋白表达水平。结果:与对照组比较,PCOS组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平明显升高(P<0.01),发情周期紊乱,停滞于发情中期,卵巢组织中出现颗粒细胞层数较少的空泡状卵泡,表明PCOS小鼠模型建立成功。CaMKⅡ蛋白在小鼠卵巢组织的卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞中均有表达;与对照组比较,PCOS组小鼠卵巢组织中CaMKⅡ荧光强度和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与空白对照组比较,sh-CaMKⅡ-1和sh-CaMKⅡ-2组KGN细胞中CaMKⅡ蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:PCOS小鼠卵巢组织中CaMKⅡ蛋白表达水平降低诱导Caspase-3蛋白表达水平升高,进而促进颗粒细胞凋亡。