MicroRNA-411a-3p靶向钙/钙调素依赖蛋白激酶4调控羊驼黑色素细胞中的黑色素生成（英文）

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色。毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的。然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA和lncRNA调控。但是,miR-411a-3p对羊驼色素形成起调控作用未见报道。为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究。经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4,CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一。双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降(34.78±16.09)%(P<0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一。miR-411a-3p通过结合CaMK4的3'untranslated region(3'-UTR)直接调控CaMK4的表达。在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著(53.66±2.11)%(P<0.01)。Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为(70.26±4.84)%(P<0.01)和(70.11±9.05)%(P<0.01)。Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒。通过紫外分光度法检测真黑素(eumelanin,EM)和褐黑素(phenomelanin,PM)显示,EM和PM的含量均被下调。结果表明,miR-411a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义。

基于CaMK4水平探讨解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr小鼠Th17/Treg平衡机制的影响

目的:考察解毒祛瘀滋阴方通过钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶-4(Ca MK4)来调控Th17/Treg细胞免疫平衡的作用机制。方法:将40只8周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为模型组、解毒祛瘀滋阴方组(中药组)、Ca MK4抑制组(KN-93组)以及醋酸泼尼松组(西药组),另选10只8周龄雌性C57BL/6J小鼠作为对照组。连续给药10周,进行尿蛋白含量测定;剥取小鼠淋巴结和肾脏,计算脏器指数;HE染色观察小鼠肾脏组织病理学变化情况;检测小鼠血清中NO浓度;RT-PCR以及Western blot检测脾脏T细胞中Ca MK4的表达水平;流式细胞术检测Th17细胞和Treg细胞的百分率以及两者的比例。结果:解毒祛瘀滋阴方能有效缓解MRL/lpr小鼠淋巴结、脾脏肿大(P<0.01),显著降低尿蛋白以及血清NO浓度(P<0.01,P<0.05),改善淋巴结和肾脏病理状态。并且,中药组小鼠脾脏T细胞中Ca MK4 m RNA及蛋白表达水平与模型组比较,显著降低(P<0.05,P<0.01),脾脏中Th17细胞显著下调(P<0.01),Treg细胞显著上调(P<0.01)。结论:解毒祛瘀滋阴方能够降低MRL/lpr小鼠脾脏T细胞中Ca MK4的表达水平,促使Th17/Treg细胞比值趋向于正常水平,提示解毒祛瘀滋阴方通过Ca MK4信号通路调控Th17/Treg细胞的免疫平衡可能是其治疗系统性红斑狼疮作用机制之一。