钙池操纵的钙离子通道在乙醇诱导的原代肝细胞钙超载及损伤中的作用

目的研究钙池操纵的钙离子通道（SOCs）在乙醇诱导的原代肝细胞钙超载及损伤中的作用。方法通过建立体外乙醇诱导原代肝细胞慢性损伤模型，检测SOCs通道蛋白分子：间质相互作用因子1（STIMl）及钙释放激活钙通道蛋白1（Orial）的表达量及胞质中游离钙离子浓度（[Ca2＋]。）的变化，并利用通道阻断剂鉴定SOCs在慢性乙醇诱导原代肝细胞钙超载及损伤中的作用。两组之间均数的比较采用f检验，多组之间的比较采用完全随机设计单因素方差分析。结果0～800mmol／L乙醇（刺激24h）浓度依赖性降低原代肝细胞的存活率；400mmol／L乙醇刺激时细胞存活率为57．34％±2．34％（MTT），因此选择400mmol／L乙醇作为下一步的刺激实验浓度。与正常对照组相比，400mmol／L乙醇刺激明显增加原代肝细胞STIMl及Orail的基因及蛋白表达量，且其表达增加持续至少72h；SOCs通道阻断剂EGTA、La”、二氨基乙氧基双苯萘酯（2-APB）干预降低400mmol／L乙醇刺激原代肝细胞增高的[ca2＋]。水平、增高原代肝细胞存活率，三者之间差异无统计学意义。结论乙醇可能通过增高原代肝细胞中SOCs通道蛋白分子表达，增加胞外钙离子内流而加重肝细胞钙超载及损伤。

钙离子通道在肺动脉高压发病机制中作用的研究进展

肺动脉高压(PAH)是一组以不受控制的肺血管重塑、持续的血管收缩和原位血栓形成为特征的临床综合征。PAH的发病机制至今仍不完全清楚,但越来越多研究表明,离子通道在PAH发病机制中具有重要作用。在离子通道中,Ca2+作为第二信使,能够参与人体内众多的生理和病理过程。电压门控钙通道、钙库操纵性钙通道、受体操纵性钙通道、牵拉激活离子通道中的Piezo1、N-甲基-D-天冬氨酸受体等钙离子通道对细胞内钙稳态至关重要,不仅可通过Ca2+浓度改变引起肺血管收缩,还可通过不同信号通路引起肺血管重塑,从而参与PAH的发生、发展。但钙离子通道在PAH中的具体作用机制仍需进一步探索。

钙池操纵的Ca^(2+)通道对炎症的调控

钙池操纵的Ca2+通道(store-operated Ca2+ channels,SOC)广泛存在于细胞膜上,是非兴奋性细胞胞外钙内流的主要通道之一,参与多种生理和病理生理过程。参与炎症和免疫反应的主要细胞多为非兴奋性细胞,SOC对它们的功能维系作用日益为人们所重视。

动脉平滑肌细胞的钙池操纵钙通道对细胞自噬的调节

目的探讨大鼠动脉平滑肌细胞A7R5上钙池操纵性钙通道(store-operated calcium channel,SOCC)对细胞自噬的影响。方法在293T细胞中包装含有STIM1、Orai1基因的慢病毒,将获得的慢病毒LV-STIM1、LV-Orai1感染大鼠A7R5细胞,Western blot检测感染前后STIM1、Orai1蛋白表达及细胞自噬调节蛋白Beclin-1的表达。慢病毒感染A7R5后饥饿处理6 h或雷帕霉素处理24 h,Western blot检测处理后各组自噬相关蛋白LC3的蛋白表达量。结果重组载体p LV-STIM1、p LV-Orai1经双酶切鉴定正确。在293T成功包装慢病毒LV-STIM1、LV-Orai1。病毒感染A7R5后,与对照组相比,STIM1、Orai1蛋白表达量分别上调96%和163%,而自噬调节蛋白Beclin 1下调64%。饥饿或雷帕霉素处理可明显增加细胞自噬水平,体现为自噬标志蛋白LC3-Ⅱ含量增加,而慢病毒感染STIM1、Orai1可明显抑制饥饿或雷帕霉素诱导的细胞自噬。结论在大鼠动脉平滑肌A7R5细胞过表达钙池操纵钙通道分子STIM1和Orai1可使细胞自噬水平降低。这一分子机制可能与肺动脉高压发病相关。

TRPC1/STIM1复合体调节人脐静脉内皮细胞钙池操纵性钙通道和受体操纵性钙通道介导的钙内流和NO生成

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/基质交联分子1(STIM1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)钙池操纵性钙通道(SOCC)和受体操纵性钙通道(ROCC)介导的钙内流和NO生成中的作用。方法取2~3代HUVEC,将构建的TRPC1和STIM1干扰质粒分别转染HUVEC,观察细胞转染效果的同时采用real-time PCR和Western blot检测TRPC1、STIM1 mRNA和蛋白的表达。将细胞分别与钙敏感受体(CaR)激动剂精胺、ROCC模拟剂(TPA)+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220及经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育后,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca2+]i和NO生成的变化;随后用TRPC1和STIM1干扰质粒同时转染HUVEC,与精胺孵育后检测[Ca2+]i和NO生成,免疫共沉淀法检测TRPC1和STIM1的相互作用。结果与Control组相比,TRPC1转染组和STIM1转染组TRPC1、STIM1 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05);在四种不同处理作用下,TRPC1转染组和STIM1转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);与Control组、TRPC1转染组及STIM1转染组相比,TRPC1和STIM1共转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);TRPC1与STIM1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的剌激下作用增强。结论 TRPC1/STIM1复合体共同调节CaR经SOCC和ROCC激活介导的钙内流和NO生成。

基质交联分子-1调控前列腺癌细胞PC-3中钙离子通道作用研究

目的探讨前列腺癌细胞PC-3在其细胞内外钙离子浓度改变时,基质交联分子-1(stromal interaction molecule 1,STIMI)实时动态表达水平及其调节钙通道的作用机制。方法利用带有STIM1-YFP荧光探针的腺病毒载体(105病毒颗粒/细胞),转染前列腺癌细胞PC-3 24h后,采用荧光显微镜和细胞计数方法检测病毒探针对细胞形态和数量的毒理影响;利用全内角反射荧光显微镜,观察STIM1在以下几种情况中在细胞膜附近的实时动态变化:100μmol/L肌浆网钙ATP酶(SERCA)抑制剂环匹阿尼酸(CPA)、2mmol/L钙离子螯合剂(EGTA)、100μmol/L卡巴胆碱。结果 STIM1荧光探针转染前列腺癌细胞不影响细胞形态和细胞数量。前列腺癌细胞PC-3在SERCA抑制剂CPA处理后,荧光强度增加到(1.45±0.2)(F/F0,n细胞数=18);当细胞外钙离子浓度降为0并加入EGTA钙离子螯合剂后,细胞荧光强度增加到(1.38±0.2)(F/F0,n=7);加入卡巴胆碱处理后,细胞荧光增加(1.62±0.3)(F/F0,n=23),刺激后荧光强度明显增加,有显著性差异(P<0.01)。结论 STIM1在前列腺癌细胞PC-3中表达并有活性;在其细胞内外钙离子浓度改变时,STIM1在细胞膜上形成多聚体,通过钙库操纵Ca^(2+)通道调节前列腺癌细胞的功能。

体外循环血浆对体外培养人脐静脉血管内皮细胞钙池操纵的钙通道电流的影响

目的探讨经体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)后人体炎性血浆对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)的钙池操纵的钙通道电流(store-operated Ca2+currents,Isoc)的影响。方法CPB后血浆采自我科心血管外科手术患者,患者均知情同意。将已培养好的HUVECs按所加入的血浆不同分为4组,每组6例:即组Ⅰ(加入CPB刚开始0min时血浆的对照组)、组Ⅱ(加入CPB后25min的血浆)、组Ⅲ(加入CPB后50min的血浆)及组Ⅳ(加入CPB后50min含左旋精氨酸的血浆)。应用全细胞膜片钳记录技术测定并观察各组HUVECs的Isoc变化。结果在HUVECs上可记录到Isoc;当钳制电位为-100mV时,组Ⅰ~组Ⅳ中HUVECs的Isoc分别为(-302.38±35.13)pA、(-388.59±58.66)pA、(-577.04±93.69)pA及(-365.42±34.79)pA,各组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中组Ⅳ明显低于组Ⅲ(P<0.01)。结论CPB后人体炎性血浆可增强血管内皮细胞的钙通道电流,左旋精氨酸可减轻此作用,这对于进一步深入研究CPB围术期血管内皮细胞钙超载的发生机制和防治具有重要意义。

SK&F96365对大鼠肝缺血再灌注损伤后Kupffer细胞钙池操纵的钙通道电流的影响

目的:研究缺血再灌注损伤对大鼠肝Kupffer细胞钙池操纵的钙通道电流(ISOC)的影响,并筛选有效的钙通道阻滞剂进行拮抗．方法:建立SD大鼠肝缺血再灌注模型,利用低浓度胶原酶循环灌注、差速离心、选择性贴壁的方法急性分离肝Kupffer细胞,应用全细胞膜片钳记录技术,研究肝缺血再灌注损伤对大鼠肝Kupffer细胞ISOC的影响及钙通道阻滞剂SK&F96365的拮抗作用．结果:大鼠Kupffer细胞的ISOC为:假手术组-78．7±25．2 pA,缺血再灌注组-159．3±27．3 pA,两组有显著统计学差异(n=15,P<0．01)．5-50μmol／L的SK&F96365对Kupffer细胞ISOC的抑制呈浓度依赖性增强,ISOC由-152．7±42．5 pA依次降至-81．4±24．2 pA,-56．1±26．4 pA,-45．2±21．6 PA,-34．8±17．1 pA,-25．6±13．4 pA,SK&F96365对Kupffer细胞ISOC的抑制率逐渐增加,分别为43．9％±18．1％,59．2％±24．0％,66．3％±23．0％,73．8％±17．8％,80．9％±12．6％,其IC50值为6．53μmol／L．结论:缺血再灌注损伤可以促进SD大鼠Kupffer细胞上SOC的进一步开放,导致ISOC的增大,Kupffer细胞活化,进一步加重缺血再灌注损伤．SK&F96365对Kupffer细胞ISOC的抑制呈浓度依赖性增强,对肝细胞损伤具有保护作用．

钙池操纵性钙通道抑制剂SKF96365对慢性哮喘小鼠气道重塑和气道高反应性的作用

目的:观察钙池操纵性钙通道抑制剂SKF96365对小鼠慢性哮喘模型气道重塑和气道高反应性的影响。方法:用鸡卵清白蛋白(OVA)致敏和激发小鼠,建立慢性哮喘模型,33只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:对照组、哮喘组、SKF96365组,每组11只,其中SKF96365组于每次激发前30 min给予SKF96365(10mg/kg)干预。哮喘组和SKF96365组于第0、7、14 d腹腔注射(i.p)200μL致敏液(含OVA粉剂20μg、氢氧化铝凝胶2 mg);自第21天起,腹腔注射1%戊巴比妥钠(70mg戊巴比妥钠/kg小鼠体重)麻醉小鼠后,OVA(40μg)滴鼻(i.n),连续6周,每周3次,共18次。对照组则在相同时间给予相应剂量的生理盐水腹腔注射和滴鼻。最后一次激发后24 h,各组分别随机取5只小鼠用于检测组织病理学变化,另6只小鼠采用Buxco小动物肺功能仪检测气道高反应性。其中组织病理学检测计算杯状细胞(过碘酸希夫染色阳性,PAS+)、胶原细胞(Masson阳性)和平滑肌细胞(α-SMA阳性)阳染面积/支气管基底膜周长值来评估小鼠气道重塑;观察给予不同浓度乙酰甲胆碱雾化时的气道阻力(resistance index,RI)最大值,评估小鼠气道高反应性。结果:对照组未见PAS阳性染色区域,哮喘组和SKF96365组杯状细胞增生高于对照组(7.29±2.04,4.49±1.70 vs 0.00±0.00,均P<0.01),且SKF96365组低于哮喘组(P<0.05)。Masson染色显示哮喘组和SKF96365组上皮下胶原沉积高于对照组(9.23±1.41,7.30±1.33 vs 1.60±0.77,均P<0.01),且SKF96365组低于哮喘组(P<0.05)。α-SMA免疫组化显示哮喘组和SKF96365组平滑肌增生肥大高于对照组(4.54±1.05,3.15±0.57 vs 1.97±0.69,均P<0.05),且SKF96365组低于哮喘组(P<0.05)。当乙酰甲胆碱(Mch)≤6.25 mg/m L时,3组小鼠气道阻力无显著差异(P>0.05),当25 mg/m L>Mch≥12.25 mg/m L时,哮喘组小鼠气道阻力明显大于对照组小鼠(P<0.001),当Mch≥25 mg/m L时,哮喘组小鼠气道阻力大于SKF96365组(P<0.05)。结论:采用SKF96365干预后,慢性哮喘小鼠气道重塑和气道高反应性指标均有改善,提示SKF96365可能对哮喘气道重塑和气道高反应性具有抑制作用。

钙池操纵的Ca^(2+)通道的激活机制研究进展

钙池操纵的Ca^(2+)通道(store-operated Ca^(2+) channels,SOC)是非兴奋细胞Ca^(2+)内流的主要通道之一,参与多种病理和生理过程,在钙信号通路的研究中,SOC的激活机制一直是人们关注的焦点之一,迄今为止,钙内流因子模型(Ca^(2+) innux factor model,CIF model)和构象耦联模型fconformational coupling model)受到广泛关注.部分学者已经从很多不同类型的细胞中提取出CIF,并证实钙非依赖性的磷脂酶A_2(Ca^(2+)-independent phospholipase A_2,iPLA_2)作为CIF的底物,在某些类型细胞的SOC激活过程中发挥重要作用,并进一步提出了ER- CIF-iPLA_2-CaM-LysoPLs-SOC通路模型.瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道蛋白与1.4,5-磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5 trisphosphate receptor,IP_3R)的结构连接作为构象耦联模型的基础已被广泛证实,随着对IP_3R,Ryanodine受体、肌动蛋白等在钙信号通路中所发挥作用的深入研究,构象耦联模型将得到不断补充和完善.SOC激活机制的破解,将对进一步完善非兴奋细胞的钙通道特性及其调节机制理论带来重大突破.

钙池操纵的Ca^(2+)通道对人肝癌细胞增殖的影响

目的:对比研究人肝癌细胞与人正常肝细胞的钙池操纵的Ca2+通道(store-operated Ca2+ channel,SOC)功能改变,探讨SOC对肝癌细胞增殖能力的影响.方法:培养人肝癌细胞(SMMC7721)与人正常肝细胞(HL-7702),应用膜片钳技术检测两组细胞的细胞膜SOC电流,应用激光共聚焦显微镜检测两组细胞的细胞内游离Ca2+离子浓度,应用MTT法检测两组细胞的增殖能力,应用流式细胞仪检测两组细胞的增殖周期.结果:人肝癌细胞的SOC电流密度为19.36pA/pF±4.9pA/pF,明显高于人正常肝细胞的电流密度8.90pA/pF±2.78pA/pF;人肝癌细胞的细胞内钙荧光强度增加31.81%±8.89%,明显高于人正常肝细胞的21.58%±6.01%;MTT生长曲线显示从第3天开始,人肝癌细胞的增殖能力明显高于人正常肝细胞,且时间越长,增殖能力差别越大;流式细胞仪研究提示人肝癌细胞的S期细胞比例(S-phase cells ratio,SPF)、增殖指数(proliferation index,PI)明显大于人正常肝细胞,从而提示人肝癌细胞的增殖能力明显高于人肝细胞.结论:与人正常肝细胞相比,人肝癌细胞的SOC电流密度增大、细胞内游离Ca2+浓度升高、增殖能力增强,提示人肝癌细胞增殖能力提高与其SOC功能增强有关.

钙池操纵性钙通道与细胞增殖关系的研究进展

Ca2+是维持细胞正常生理功能的重要离子,参与细胞信息传递并调控一系列生命过程。钙池操纵性钙通道(SOCC)是细胞膜钙通道的一种。许多细胞内Ca2+主要通过SOCC机制影响正常细胞和肿瘤细胞的生长增殖。不同类型的细胞,SOCC通道相关蛋白的表达量及其相互作用存在差异,从而影响细胞内Ca2+浓度,造成细胞的增殖、凋亡和迁移等生物学功能的改变。

规范瞬时受体电位离子通道对血管重构的作用机制及研究进展

规范瞬时受体电位离子通道(canonical transient receptor potential channel,TRPC)对钠和钙离子具有通透性。各种TRPC同聚体或异聚体复合物调节着血管中平滑肌和内皮细胞的诸多生理功能,它们的异常表达通常与高血压、内皮通透性增加等疾病的发生相关,是导致血管重构的重要分子基础。因此,研究TRPC在血管重构过程中的作用,能够为疾病的治疗提供新思路。

钙池操纵的钙通道在屋尘螨诱导哮喘小鼠气道上皮屏障破坏中的作用

目的:研究钙池操纵的钙内流(SOCE)在哮喘小鼠气道上皮屏障破坏中的作用及可能机制。方法:建立屋尘螨(HDM)致敏的C57BL/6急性过敏性哮喘小鼠模型,分为正常对照组、哮喘模型组和SOCE阻断剂BTP-2干预的哮喘模型组,剔除造模过程中死亡鼠和肺泡灌洗失败小鼠,每组10只。肺组织HE染色评估肺组织炎症,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-13和血清中IgE水平。右旋糖酐通透性实验评估屏障通透性,肺免疫荧光及肺组织化学染色评估连接蛋白(ZO-1和occludin)的分布和表达,RT-PCR和Western Blot评估肺组织中连接蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,HDM致敏的小鼠气道炎症加重,肺组织ZO-1、occludin的mRNA和蛋白表达水平显著降低,同时右旋糖酐通透性增高(P<0.0001);与哮喘模型组相比,BTP-2干预组小鼠气道炎症减轻,ZO-1、occludin的mRNA和蛋白表达水平较哮喘组增高,右旋糖酐通透性亦明显下降(P<0.0001)。结论:SOCE及其介导的钙信号可能参与了HDM诱导的小鼠气道上皮屏障的破坏。

STIM、Orai及其介导的钙池操纵钙内流

STIM-Orai介导的钙池操纵钙内流(SOCE)是一种重要的钙信号产生机制.SOCE参与调控机体的基因表达、细胞增殖、器官发育、免疫反应等各类生理活动,并与多种疾病发生密切相关.本文综述了SOCE概念提出,利用RNAi及高通量筛选技术发现2种介导SOCE的蛋白的进程,并从结构和功能方面介绍了STIM、Orai蛋白家族的最新研究进展,为进一步探索STIM、Orai的功能及其相互作用机制提供一些思路.

中药化学成分对血管平滑肌离子通道的调控研究

钙通道和钾通道是血管平滑肌细胞上最重要的离子通道 ,二者共同维持着血管张力的平衡。阻断血管平滑肌上的电压操纵性钙通道 (VOC)和 (或 )受体操纵性钙通道 (ROC)可导致血管平滑肌的舒张 ,同时激活钙激活钾通道 (Kca)使血管平滑肌的舒张更加明显。许多中药的有效成分均通过影响这两类通道的开放关闭来调节血管平滑肌的张力状态 ,发挥其扩管、降压、改善微循环的作用 ,从而治疗冠心病、缺血性脑病。对左旋千金藤定碱、红花提取物、三七皂甙、黄芩、川芎嗪、丹参提取物等多种中药有效成分的作用机理进行综述。

白藜芦醇对肺癌A549细胞放疗的增敏效果及其与钙池操纵性钙内流的关系

目的探究白藜芦醇(Res)对肺癌A549细胞放疗的增敏效果及其与钙池操纵性钙内流(SOCE)的关系。方法不同浓度Res联合不同剂量放射治疗(RT)处理A549细胞后,通过镜下观察和线粒体膜电位检测比较细胞增殖、凋亡情况,再通过钙成像技术和Western blot法检测SOCE及其关键蛋白的表达情况。结果与单一处理方式相比,RT+Res可以抑制A549细胞中的SOCE过程(P<0.05)。Res联合RT可以降低STIM1和Orai1蛋白在肿瘤细胞中的表达(P<0.01)。结论Res可以增强肺癌A549细胞的RT效果,而这种作用可能与抑制STIM1和Orai1介导的SOCE有关。

钙池操纵性钙内流对特应性皮炎上皮屏障功能的影响

目的:探讨钙池操纵性钙内流(SOCE)及其介导的钙信号在特应性皮炎(AD)上皮屏障破坏中的作用。方法:6周龄BALB/c小鼠,采取胶带粘贴及1%DNCB致敏法建立AD模型,分为对照组、AD组、SOCE抑制剂BTP2处理的AD组(AD-BTP2)和外用糖皮质激素处理的AD组(AD-TCS)。采用组织学检查表皮厚度,通过皮水分丢失(TEWL)测定小鼠皮肤屏障功能。体外培养角质形成细胞HaCaT,分为对照组、尘螨(HDM)提取物刺激组和HDM刺激并BTP2干预组(HDM-BTP2),采用MTT法进行细胞增殖试验,RT-PCR、Western Blot法分别检测SOCE及上皮屏障相关基因的表达。FITC-右旋糖酐通透性实验评估HaCaT细胞屏障功能。结果:AD组小鼠较对照组小鼠的经皮水分丢失和表皮增厚均更为显著(P<0.0001);而BTP2处理后AD小鼠的经皮水分丢失(P<0.05)和表皮增厚(P<0.0001)进一步加重。HDM刺激可以促进HaCaT细胞的增殖,而BTP对细胞增殖没有影响。HDM刺激后HaCaT细胞SOCE相关蛋白Orai1~3,STIM1~2和SARAF的mRNA表达与对照组细胞无差异,但Orai1蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)。HDM刺激HaCaT细胞后屏障相关闭合蛋白Occludin和兜甲蛋白Loricrin表达下调;而BTP2处理后可以恢复Occludin和增加E-cadherin的表达。HDM组HaCaT细胞的FITC-右旋糖酐通透性高于对照组细胞,而1μmol/L BTP2可以显著降低HDM诱导的FITC-右旋糖酐通透性改变。结论:在AD动物模型和细胞水平,SOCE抑制剂BTP2对上皮屏障具有相反的效应,提示SOCE在2型炎症中作用的复杂性,相关机制还需要进一步研究。

骨形态形成蛋白4增强大鼠远端肺动脉平滑肌细胞中的经典瞬间受体离子通道表达和钙池操纵性钙离子内流及基础钙水平

背景和目的：近期研究结果表明骨形态形成蛋白4（BMP4）在肺血管重塑中发挥重要作用，但其作用机制尚不明确。在我们的早期研究中已发现钙离子通过钙池操纵性钙离子通道（SOCC）内流可能是导致慢性缺氧性肺动脉高压的致病因素之一，

糖尿病血管平滑肌细胞钙离子稳态调节的改变与细胞增殖

糖尿病已成为第三大威胁人类健康的疾病。目前虽然在临床上能有效控制患者血糖水平,但是糖尿病患者最终死亡于合并症。研究表明,糖尿病可加速动脉粥样硬化,粥样斑块的平滑肌细胞显示更强的增殖能力。Ca2+作为胞内重要的信使参与细胞的许多生理活动,如细胞的增殖、凋亡等等。胞内钙离子的升高主要来源于胞外钙离子的内流与胞内钙池的释放。胞内钙池主要由IP和ryanodine两大钙池系统组成,它们共同调节着胞内钙离子运动。