体外高通量评价过敏反应模型的建立及其对潜在过敏原异莲心碱的评价研究

目的建立体外高通量评价过敏反应模型,并对中药单体化合物进行筛选,从而确定其中的潜在过敏原。方法建立稳定表达MrgX2的高通量药物筛选细胞模型。首先将重组质粒pm Cherry-C1-MrgX2转染人胚肾HEK293细胞,通过G418筛选建立稳定表达人MrgX2的细胞株;再通过MrgX2特异性激动剂C48/80和拮抗剂2-APB检测细胞株的功能和稳定性,以Z因子确认高通量体系的稳定性和可靠性。采用上述模型对180个单体化合物进行筛选,以EC_(50)、IC_(50)、特异性及毒性确定该激动剂的功能性。结果 MrgX2细胞模型对特异性激动剂C48/80和特异性拮抗剂2-APB的EC_(50)和IC_(50)分别为2.7μg/m L和46.29μmol/L,MrgX2细胞模型第1代和第20代对激动剂的反应基本一致,该模型Z因子为0.78。筛选得到异莲心碱为阳性激动剂,其功能验证结果为:EC_(50)为4.5μmol/L、IC_(50)为39.47μmol/L,只能特异性激动MrgX2受体,且无细胞毒性。结论采用钙流方法可成功构建基于过表达细胞系HEK293/MrgX2的体外高通量评价过敏反应模型,并且初步确定异莲心碱为潜在引发过敏反应的过敏原。

一种靶向于生长抑素受体2的药物筛选模型的建立与应用

目的 以生长抑素受体2(SSTR2)为靶点,建立生长抑素类似物(SSTA)活性检测的细胞模型,为SSTR2激动剂以及SSTA的药物筛选提供一种简单稳定的评价方法。方法 将SSTR2目的基因整合入pEGFP-N3载体中,构建重组质粒SSTR2-pEGFP-N3,并转染进HEK293细胞,使用G418筛选后挑取阳性克隆,扩大培养获得稳转细胞株。通过荧光细胞成像、免疫蛋白印迹、qPCR等方法对获得的稳转细胞株进行鉴定。建立钙流检测体系,对该体系细胞数量、荧光指示剂浓度、孵育时间等条件进行优化。最后利用建立的筛选模型对不同批次的上市药物生长抑素制剂思他宁进行检测。结果 成功构建SSTR2稳转细胞株,受体主要分布在细胞膜上。确定钙流检测最优条件为:30 000个细胞每孔,Fluo-4/AM指示剂浓度为3 μmol·L -1 ~5 μmol·L -1 ,孵育时间为45 min。在该条件下,不同批次的思他宁EC 50 值稳定。结论 成功构建SSTR2稳转细胞株,并优化钙流检测方法,为生长抑素受体激动剂的筛选提供了一种简单稳定的模型。

菜粉蝶Pain离子通道基因的克隆和功能研究

通过克隆十字花科蔬菜重要害虫菜青虫Pieris rapae瞬时感受器电位通道中的Painless(Pain)基因,实现它的体外功能性表达,为进一步研究其在鳞翅目昆虫中的生理功能提供重要依据。根据菜青虫的转录组数据,采用RT-PCR克隆菜青虫Pain基因得到完整开放阅读框;利用哺乳动物表达系统在体外表达菜青虫Pain离子通道。鉴定出菜青虫Pain基因是GenBank登录号为NW_019093434.1的序列。其完成开放阅读框由2850个核苷酸组成,编码949个氨基酸。预测蛋白分子量为108.3 kDa,理论等电点pI为5.37。预测该基因所编码蛋白序列有2个结构域,分别是包含8个锚蛋白重复序列的锚蛋白结构域和6个跨膜区的跨膜结构域。氨基酸序列比对结果显示菜青虫Pain和家蚕、帝王蝶、小菜蛾以及烟草天蛾Pain的序列相似度都高达70%以上,但与黑腹果蝇Pain的序列相似度仅有31%。进化分析结果显示菜青虫Pain离子通道和小菜蛾以及帝王蝶的Pain离子通道的亲缘关系最近。体外钙流检测结果表明,菜青虫Pain离子通道可被43℃缓冲液激活,这说明菜青虫Pain离子通道可以感受高温。

以黑色素浓集荷尔蒙受体为靶点高通量筛选细胞模型的建立

背景:研究表明,激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能。目的:建立以MCHR为靶点的高通量筛选细胞模型。设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/11在中国科学院北京基因组研究所药理组实验室完成。材料:人胎脑TotalRNA购自STRATAGENE公司,经中国科学院北京基因组研究所药理组反转录为cDNA文库;人胚肾细胞系HEK293由中国医学科学院基础所细胞中心提供。方法:首先从人胎脑cDNA文库中得到MCHR1和MCHR2的全长cDNA,并将其克隆到pcDNA3.1载体中,构建人MCHR1,MCHR2基因的表达质粒,继而转染人胚肾293,通过G418筛选建立了稳定的表达人MCHR1和MCHR2的细胞株;进一步通过人MCHR的内源激动剂MCH及人MCHR1的特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175来检测细胞株的功能和稳定性。主要观察指标:通过对钙离子敏感的荧光指示剂Fluo-3,检测细胞内部反映钙离子浓度变化的荧光值,通过荧光值计算出反映受体活性的半数有效浓度EC50和半数抑制浓度IC50值,以及反映系统可靠性的Z因子。结果:实验建立了稳定表达MCHR1,MCHR2的高通量药物筛选细胞模型,对所建立细胞模型的功能、稳定性、特异性、高通量等特点进行检测。MCHR1细胞模型对MCH的EC50值为17.72nmol/L,对起特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175的EC50和IC50分别为37.42nmol/L和13.6nmol/L。而MCHR2细胞模型对MCH的EC50值为3nmol/L,对HD-01和ATC0175则没有反应,MCHR1和MCHR2细胞模型的第1代和25代对激动剂和拮抗剂的反应是基本一样的。MCHR1和MCHR2细胞模型的Z因子为0.61和0.73,并对筛选条件进行了优化,确定了实验系统中细胞的数量为3×104个/孔和二甲基亚砜的终浓度为不超过10g/L系统最佳。结论:采用钙流测定方法可成功建立稳定的MCHR1和MCHR2筛选细胞株及可靠的筛选方法,该细胞模型可同时用于人MCHR激动剂与拮抗剂的筛选。

GPR120选择性剪切异构体2的高通量药物筛选细胞模型的构建

目的:建立GPR120选择性剪切异构体2的功能性筛选模型,筛选GPR120的激动剂和抑制剂,开发防治糖尿病等疾病的药物。方法:从健康人胎脑cDNA文库中得到缺失了第3外显子的GPR120选择性剪切异构体2(hGPR120-s)的cDNA,将其克隆到pcDNA3载体中,构建pcDNA3/hGPR120-s重组表达质粒,继而转染HEK293细胞,通过G418筛选,获得稳定表达该异构体的真核重组细胞系。利用特异性配体亚麻酸和GW 9508探索和优化了筛选条件。并初步应用该模型研究各种天然脂肪酸的构效关系。结果:建立了稳定可靠的高通量筛选模型,Z因子=0.69。结论:该系统适合于GPR120激动剂的高通量筛选。