大电导钙激活钾通道在肥胖相关性肾病中的作用及研究进展

随着社会经济的发展和生活水平的提高,肥胖成为全球性的公共卫生问题甚至是社会问题,肥胖作为心血管疾病的危险因素已经被广泛认同,而作为肾脏疾病的危险因素正在逐渐受到重视。有报道,肥胖患者中约40%出现蛋白尿[1]。以后有个案及临床观察[2-4]均证实肥胖可引起肾脏损害。我们课题组一直对肥胖引起的肾脏损害很感兴趣,围绕肾小球上各种通道蛋白的定位和功能,及相关的信号转导通路和复杂的病理生理机制进行研究[4-6].

环状RNA mmu_circ_0005019影响小鼠心肌细胞钙激活钾通道电流及动作电位

目的 探索环状RNA mmu_circ_0005019调控小电导钙激活钾(small-conductance calcium-activated potassium, SK)通道蛋白亚基SK3编码基因Kcnn3的表达,以及对小电导钙激活钾通道电流(IK,Ca)和动作电位时程(action potential duration, APD)的影响。方法 在小鼠HL-1细胞中分别构建mmu_circ_0005019过表达和干扰模型,分为过表达组(n=3)、空质粒组(n=3)、干扰1组(n=3)、干扰2组(n=3)、对照组(n=3),通过RT-qPCR、Western blot分析mmu_circ_0005019调节Kcnn3表达的分子机制,应用膜片钳技术电流钳模式记录全细胞的IK,Ca,并用电压钳模式记录APD。结果 成功构建了环状RNA mmu_circ_0005019过表达和干扰的HL-1细胞模型。过表达组的Kcnn3基因表达与空质粒组相比明显上调(P<0.05);干扰1组和干扰2组的Kcnn3基因表达与对照组相比均明显下调(P<0.05)。电生理发现过表达mmu_circ_0005019增加了HL-1细胞IK,Ca电流密度,APD显著缩短;相反,干扰mmu_circ_0005019减少了IK,Ca电流密度,APD显著延长。结论 mmu_circ_0005019可以上调小鼠HL-1细胞Kcnn3的表达水平,从而改变IK,Ca和APD,提示环状RNA mmu_circ_0005019可能在房颤发生中起到促进作用。

Anoctamin家族中钙激活氯离子通道调节剂筛选及应用研究进展

钙激活氯离子通道(CaCC)是一类能通过胞内钙离子激活转运氯离子的通道蛋白,其主要在神经元和肌细胞中参与调节膜电位、细胞内钙平衡和细胞兴奋性等重要的生理作用。Anoctamin(Ano)家族中Ano1是最经典的CaCC,Ano1的靶向调节剂对癌症、囊性纤维化、高血压、腹泻和哮喘等疾病具有潜在治疗作用。自2008年Ano1首次被发现后,先后出现了多种CaCC特异性调节剂的筛选方法,主要包括基于荧光蛋白的高通量初级筛选、电生理膜片钳技术和虚拟筛选,进而发现了多种药理学作用不同的小分子调节剂。本文综述了目前较为主流的筛选方法的原理和优缺点,并对迄今发现的Ano1特异性调节剂的化学结构和潜在的应用进展进行综述。

黄牛肉中钙激活酶系统的动力学性质

【目的】阐明牛肉中钙激活酶系统的主要动力学特征。【方法】通过温度、时间、Ca2+浓度、反应时间、酶量、底物浓度等的变化,分析μ-钙激活酶,m-钙激活酶和钙激活酶抑制蛋白的动力学特性。【结果】随冷冻温度的升高和贮存时间的延长,钙激活酶系统活性都逐步降低,但冷冻处理可以显著降低钙激活酶抑制蛋白的活性,而钙激活酶对冷冻处理不太敏感;μ-钙激活酶达到最大活性一半时所需的Ca2+浓度为50μmol·L-1,m-钙激活酶为320μmol·L-1;在测定钙激活酶活性时,反应时间应控制在60min以内,酶活单位应小于0.45;在以酪蛋白为底物时,m-钙激活酶的Km值为3.185mg·mL-1,Vmax为0.015U·min-1,而μ-钙激活酶的Km值为5.320mg·mL-1,Vmax为0.017U·min-1。【结论】钙激活酶系统活性受贮藏温度和时间、Ca2+浓度、酶促反应时间、酶量、底物浓度影响明显。

大电导钙激活钾通道与肺动脉高压关系的研究进展

肺动脉高压(PH)是临床的常见疾病,由多种异源性疾病和不同发病机制所致肺血管结构或功能改变,引起肺血管阻力和肺动脉压力升高的临床和病理生理综合征,继而发展成右心衰竭,甚至死亡[1],其发病率高,影响全球约1%的人口,在65岁以上的人群中PH患病率约10%[2]。

钙激活氯通道跨膜蛋白16A在肿瘤诊断与治疗中的桥梁作用

钙激活氯通道(Ca^(2+)activated chloride channels,CaCCs)首次发现于非洲爪蟾卵母细胞中^([1])。跨膜蛋白16A(Transmembrane protein 16A,简称TMEM16A),也被称为ANO1、DOG1、TAOS2及ORAOV2,作为CaCCs的分子身份于2008年被三个科研团队揭示^([2-4])。钙激活氯通道TMEM16A受膜电压、细胞内钙浓度和细胞外渗透性阴离子调控^([5])。生理条件下,TMEM16A在上皮细胞的液体分泌、胃肠道平滑肌收缩及神经元兴奋与膜电位调节等方面发挥重要的生理功能^([6-7])。在疾病状况下,如恶性肿瘤、高血压、囊性纤维化及脑中风,TMEM16A表达发生异常改变^([6-9])。

小电导的钙激活钾离子通道1的真核表达及其在乳腺癌细胞增殖中的作用

目的构建重组的真核表达质粒pENTER-小电导的钙激活钾离子通道1(small conductance calcium-gated K+channel 1,SK_(Ca)1),并研究其在乳腺癌细胞密歇根癌症基金会7号(Michigan cancer foundation-7,MCF-7)中的表达;观察SK_(Ca)1的亚细胞定位;检测SK_(Ca)1在乳腺癌细胞增殖中的作用。方法从MCF-7细胞中抽提总RNA并逆转录成cDNA;以cDNA为模板扩增SK_(Ca)1基因,通过无缝克隆技术将基因片段克隆至真核表达质粒pENTER中;质粒转染MCF-7细胞后,分别用Western blot和免疫荧光实验检测SK_(Ca)1的表达及亚细胞定位,用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)实验测定SK_(Ca)1的细胞增殖效应。结果成功构建了带有标签的重组真核表达质粒pENTER-SK_(Ca)1,并在乳腺癌细胞MCF-7中高效表达;SK_(Ca)1主要分布于细胞质和细胞核,并能促进乳腺癌细胞增殖。结论成功制备了研究SK_(Ca)1的必要工具原料并对其分子机制进行了初步探索,为深入研究SK_(Ca)1在乳腺癌细胞中的信号转导作用奠定了基础。

逼尿肌不稳定中钙激活钾/氯通道mRNA表达差异的实验研究

目的 探讨钙激活钾 氯通道在正常和不稳定逼尿肌组织中的mRNA表达变化。方法 雌性Wistar大鼠采用会阴部尿道结扎法制作成膀胱出口梗阻 (bladderoutletobstruction ,BOO)模型 ,经清醒状态膀胱测压确定逼尿肌不稳定(detrusorinstability ,DI)后 ,提取正常与DI逼尿肌组织mRNA ,以RTPCR方法研究组织中大电导钙激活钾通道 (bigconduc tancecalciumactivatedpotassiumchannel,Bkca)、小电导钙激活钾通道 (smallconductancecalciumactivatedpotassiumchannel,Skca)、钙激活氯通道 (calciumactivatedchloridechannel ,Clca)的mRNA表达 ,凝胶成像分析比较其差异性变化。结果 大鼠尿道梗阻后DI发生率 76 17%,膀胱容量及最大逼尿肌压显著增加 (P <0 0 1)。钙激活钾 氯通道在两组大鼠逼尿肌中均有表达 ,其中Bkca、Skca2、Skca3明显降低 ,而Clca明显升高。结论 钙激活钾 氯通道的表达改变可影响逼尿肌兴奋性的反馈调节 ,在逼尿肌不稳定的发病机制中有重要作用。

m-钙激活酶的分离纯化方法研究

本试验对牛脾脏中的m-钙激活酶进行了分离纯化,以便进一步研究其动力学特性和在牛肉成熟中的作用。对宰后30min牛肉匀浆后利用超高速冷冻离心、离子交换层析、疏水层析等技术,从中分离纯化出了m-钙激活酶,测得其比活力为39.7U/mg。利用变性电泳对纯化后的样品进行了验证。

钙激活酶的高压反应动力学研究

通过对真空包装的牛肉施加不同的压力 (10 0 Mpa～ 35 0 Mpa)和不同时间的处理 ,分析测定牛肉中钙激活酶和钙激活酶抑制蛋白活性的变化规律 ,研究了钙激活酶及其抑制蛋白的压力动力学 ,并探讨了高压嫩化牛肉的作用机理。结果表明钙激活酶对压力有一定的耐受性 ,而钙激活酶抑制蛋白对压力较敏感。

钙激活钾/氯通道对大鼠逼尿肌不稳定调节作用的实验研究

目的 研究钙激活钾 /氯通道对逼尿肌不稳定的调节作用的变化 ,探讨其在逼尿肌不稳定 (Detrusorinstability ,DI)发生中的作用。方法 采用Wistar大鼠DI模型 ,常规制备正常及DI逼尿肌条 ,体外张力测定其自发收缩频率和幅度 ,观察通道阻断剂及开放剂的作用。结果 DI组自发收缩频率与张力较对照组显著增加。大电导钙激活钾通道 (Bigcon ductancecalciumactivatedpotassiumchannel,BKca)阻断后 ,对照组频率降低而张力增加 ,DI组仅频率明显提高 ,开放后对照组频率与张力均降低 ,DI组仅频率明显下降。小电导钙激活钾通道 (Smallconductancecalciumactivatedpotassiumchannel,SKca)阻断后两组的频率与张力均明显增加 ,而开放后则对照组均降低 ,DI组仅频率下降。钾通道阻断或开放后对照组频率与张力的变化幅度明显高于DI组。钙激活氯通道 (Calciumactivatedchloridechannel ,Clca)阻断后 ,DI组频率与张力下降 ,而对照组无明显改变。结论 钙激活钾 /氯通道反馈调节逼尿肌的收缩 ,DI时Kca作用下调而Clca作用上调 。

动物宰后钙激活酶系统的作用机制

从肌肉到食用肉的转化是一个复杂的过程,它导致尸体肌肉中的一系列状态大大不同于它们在活体中的状态。动物死后肌肉的嫩化与肌原纤维蛋白降解有关。钙激活酶和其内在的抑制物钙激活酶抑制蛋白是引起肌原纤维蛋白降解的主要因素。

子宫平滑肌大电导钙激活钾通道与小窝蛋白相互作用和宫缩乏力性产后出血的关系研究

目的:探讨产妇子宫平滑肌大电导钙激活钾通道(BKCa)与小窝蛋白相互作用在宫缩乏力性产后出血发病中的作用。方法:采用免疫荧光双染法及激光共聚焦显微镜观察30例宫缩乏力性产后出血产妇(病例组)和30例宫缩正常无产后出血产妇(对照组)子宫平滑肌BKCa(α亚基)与小窝蛋白-1、BKCa(α亚基)与小窝蛋白-2的共定位情况;采用免疫共沉淀法检测两组产妇子宫平滑肌BKCa(α亚基)与小窝蛋白-1、BKCa(α亚基)与小窝蛋白-2的相互作用关系。结果:(1)两组子宫平滑肌细胞均有BKCa(α亚基)、小窝蛋白-1和小窝蛋白-2表达,其中BKCa(α亚基)主要位于细胞膜表面,而小窝蛋白-1和小窝蛋白-2在细胞膜表面和细胞质均有表达;且BKCa(α亚基)与小窝蛋白-1、BKCa(α亚基)与小窝蛋白-2均有部分区域共表达于细胞膜。(2)病例组子宫平滑肌BK-Ca(α亚基)免疫沉淀物中小窝蛋白-1、小窝蛋白-2蛋白水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:宫缩乏力性产后出血产妇子宫平滑肌细胞中BKCa(α亚基)免疫沉淀物中小窝蛋白-1、小窝蛋白-2蛋白水平升高,提示小窝蛋白与BKCa(α亚基)相互作用增强可能是宫缩乏力性产后出血发病的重要原因之一。

钙激活酶激活蛋白的研究进展

钙激活酶 (calpain)是促进宰后肌肉嫩化的主要的内源酶。钙激活酶激活蛋白 (calpainactivator)是钙激活酶系统的成员之一 ,是区别于钙激活酶抑制蛋白 (calpastatin)的钙激活酶的正调节蛋白。目前已对其激活特性、氨基酸序列及cDNA序列实行了研究 ;但其结构和激活机理还不清楚。

钙离子和钙激活酶外源抑制剂对牛肉钙激活酶活性和超微结构的影响

3头改良黄牛 (鲁西黄牛×犁木赞 )在屠宰厂按照标准的屠宰工艺屠宰并预冷 2 0h后取样 ,样品分 7组 ,按样品重 10 %分别注射蒸馏水 (对照 )、 2 0 0mmol·L-1CaCl2 、 2 0 0mmol·L-1EGTA、 2 0 0mmol·L-1ZnCl2 、 0 2mg·mL-1亮抑蛋白酶肽、 0 2mg·mL-1亮抑蛋白酶肽 +0 0 1mg·mL-1TritonX 10 0、 0 0 1mg·mL-1TritonX 10 0 7个不同处理 ,将样品分别成熟 3、8和 16d后测 μ 钙激活酶 (μ calpain)和m 钙激活酶 (m calpain)的活性并观察肌纤维超微结构。实验结果发现 ,与注射CaCl2 的牛肉相比 ,注射外源性钙激活酶抑制剂 (亮抑蛋白酶肽、ZnCl2 )牛肉的 μ 钙激活酶保持活性时间延长 ,超微结构变化受到抑制。提示 ,钙激活酶特别是 μ 钙激活酶很可能参与了牛肉嫩化过程并发挥着关键作用。

川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

本工作旨在研究川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞钾通道的作用,为阐明其扩张冠状动脉血管的机制提供实验依据。采用膜片钳细胞贴附式和内面向外式记录方式观察川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+- activated potassium channels,BKCa channels)的作用,分别用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89和蛋白激酶G (protein kinase G,PKG)抑制剂KT-5823处理细胞,再观察川芎嗪对BKCa通道作用的变化。结果表明在研究的0．73-8．07 mmol/L浓度范围,川芎嗪可以剂量依赖性地激活BKCa通道,使通道的开放概率从(0．01±0．003)增加到(0．03±0．01)-(．21± 0．18)(P<0．01,n=10),使通道平均关闭时间从(732．33±90．67)ms降低到(359．67±41．30)-(2．96±0．52)ms(P<0．01, n=10)。川芎嗪的这种激活作用在浴液游离钙离子浓度接近0 mmol/L时也存在。PKA的特异性抑制剂H-89(3 μmol/L)和 PKG的特异性抑制剂KT-5823(1 μmol/L)对川芎嗪激活BKCa通道的作用无影响。以上结果提示:川芎嗪能直接激活冠状动脉平滑肌BKCa通道,这种作用可能是川芎嗪扩张冠状动脉血管的一种重要机制。

槲皮素对原发性高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道活性的影响

背景槲皮素是是一种自然界广泛分布的具有多种生物活性的黄酮类化合物。大量研究已证实槲皮素能够通过多种方式实现降血压效应。但是对于槲皮素通过离子通道降血压的机制目前还不十分清楚。目的观察槲皮素对高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(K_(Ca))活性的影响,以探讨槲皮素通过离子通道降血压的机制。方法选取需择期行腹部手术者,共26例,分为两组,血压正常组14例,原发性高血压(EH)组12例。取肠系膜动脉小分支,用急性酶消化法获得单个肠系膜动脉平滑肌细胞。然后应用单通道细胞膜片钳技术观察不同浓度槲皮素对肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道开放概率(P_o)、电流幅度值(A_m)、平均开放时间(T_o)、平均关闭时间(T_c)等各指标的影响。结果在 inside-out patch 方式下,随着浴液中槲皮素浓度依赖性地增高正常血压者和高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞 K_(Ca)通道 P_o,通道 A_m及通道 T_o 变化不大,而通道 T_c 均明显缩短。各槲皮素浓度下的两组 K_(Ca)通道 P_o 增长率(⊿P_o%)差异无统计学意义。结论槲皮素能直接激活人类血管平滑肌细胞 K_(Ca)通道。高血压患者和正常血压者血管平滑肌细胞 K_(Ca)对槲皮素的反应性无明显区别。槲皮素激活钙激活钾通道可能是其降血压的一种机制。

肿瘤坏死因子-α激活ECV304钙激活钾通道及G蛋白的增强效应

目的 观察肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)对人脐静脉内皮细胞株 ECV30 4钙激活钾通道 (BKca)的影响以及 G蛋白是否在此过程中起作用。方法 细胞贴附式膜片箝技术。结果 发现 ECV30 4细胞膜上存在大电导钙激活钾通道 (BKca) ,它的电导是 (2 0 2 .5 4± 16 .6 2 ) p S,其活动可被 2 0 0 U / m l TNF-α增强 ,G蛋白在此过程中起介导作用。结论 TNF-α作用于内皮细胞 ,快速激活 BKca,促进钾离子大量外流 ,使细胞膜发生超极化 ,增大静息钙离子内流的电化学驱动力 ,开放静息钙通道升高静息胞内钙离子浓度。G蛋白可增强此激活效应。

三磷酸肌醇对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

应用膜片钳单通道电流记录技术,研究三磷酸肌醇(trisphosphate inositol,IP3)对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+-activated potassium channels,BK channels)的作用.结果显示:在内面向外式(inside-out)膜片下,IP3(10～50μmol/L)可以浓度依赖性地增加通道的开放概率,而对电流幅值无明显影响,开放概率的增加是通过明显缩短平均关闭时间实现的(n=11,P＜0.01);洗去药物后通道活性可以恢复到对照水平;IP3对通道的激活作用不随时间而衰减;IP3的降解产物对通道没有明显的激活作用.结果表明:在inside-out膜片下,IP3能够激活猪冠状动脉平滑肌细胞BK通道.