钙激活Cl^-通道阻断剂对哮喘气道黏液高分泌的抑制研究

目的观察小鼠钙激活Cl-通道阻断剂尼氟灭酸(Niflumic acid,NFA)对哮喘小鼠气道黏液高分泌的抑制作用。方法将BABL/c小鼠随机分为哮喘组、吸入NFA预防组和正常对照组。AB-PAS特染法检测各组小鼠小支气管杯状细胞的数量及黏液分泌状况。RT-PCR法检测各组肺组织中黏蛋白MUC5AC mRNA和mClCA3 mRNA水平。结果正常对照组小支气管只有少量散在分布的杯状细胞,管腔干净;而哮喘组出现大量簇状分布的杯状细胞,胞质内富含着色颗粒,管腔具有着色黏液;NFA预防组的杯状细胞数量与正常对照组相近。哮喘组的MUC5AC及mClCA3 mRNA水平均显著高于正常对照组;NFA预防组的MUC5AC mRNA水平与正常对照组接近,而mClCA3 mRNA水平稍高于正常对照组。结论NFA能有效抑制哮喘小鼠气道杯状细胞数量的增加及黏蛋白的合成,这一效果是通过阻断mCLCA3活性和降低其表达水平来实现的。

分泌性腹泻对小鼠钙激活Cl^-通道基因表达的影响

目的探讨肠道组织钙激活Cl^-通道(CLCAs)基因表达与分泌性腹泻发生的关系。方法选取昆明小鼠24只,雌雄各半,随机分为3组:对照组、实验1h和8h组,每组8只。对照组小鼠经腹腔注射0.2ml生理盐水,实验组小鼠经腹腔注射脂多糖(LPS,6mg/kg)分别作用1h和8h,于注射后观察小鼠活动特征及肠道组织形态,以判定分泌性腹泻模型的建立,利用实时光定量PCR法检测各段肠道组织CLCAs基因的表达。结果 LPS成功诱导小鼠发生了分泌性腹泻;小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠中均有CLCAs基因的转录;注射LPS后,十二指肠、空肠、回肠和结肠的CLCA1、CLCA2、CLCA3、CLCA4、CLCA6基因转录水平均发生上调,与1h组相比,8h组各基因转录水平显著上调。注射LPS后,十二指肠未检测到CLCA5的表达,但空肠、回肠CLCA5的表达均上调。结论 LPS引起的分泌性腹泻与各肠段CLCAs基因的差异表达有关。

异种同源钙激活Cl^-通道DNA疫苗抑制哮喘小鼠气道黏液高分泌的研究

目的 钙激活Cl-通道 (CLCA)家族中小鼠mCLCA3与人hCLCA1是异种同源蛋白 ,两者表达于气道上皮杯状细胞。拟探讨hCLCA1DNA疫苗对哮喘小鼠气道黏液高分泌状况的影响。方法 构建重组真核表达质粒pSecTag2B/hCLCA1,将其作为疫苗肌注法接种给BALB/c小鼠 (隔 2周 1次 ,共4次 )。当酶联免疫吸附法 (ELISA)证实血清中有能结合mCLCA3胞外肽段 (ED)的抗体产生时 ,卵蛋白致敏法制备接种小鼠的哮喘模型。引喘 5d后 ,PAS特染黏蛋白法观察气道杯状细胞数量及分泌功能 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法检测黏蛋白MUC5ACmRNA水平的变化。设接种pSecTag2B/mCLCA3、空载体pSecTag2B和生理盐水为对照组。结果 ELISA证实疫苗接种 3次后的小鼠血清抗体 ,能有效结合mCLCA3的 3个ED。其中抗体与N 端和C 端ED的结合滴度大于与中间ED的结合滴度。与同样被诱发哮喘的对照组相比 ,疫苗接种组小鼠气道的杯状细胞数量和黏液分泌量明显减少 ,MUC5ACmRNA转录水平下降。结论 hCLCA1DNA疫苗能诱导小鼠产生结合自身mCLCA3胞外肽段的抗体 ,并因此有效减轻了哮喘气道黏液高分泌。

增强型绿色荧光蛋白融合对Ano1钙激活Cl-通道生理特性的影响

本研究旨在探讨融合在Ano1钙激活Cl^-通道(anoctamin1)C末端的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对Ano1生理特性的影响。分别构建融合和未融合EGFP的Ano1真核表达载体,通过脂质体介导分别将这两类真核表达载体转染至Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞,倒置荧光显微镜下观察融合和未融合EGFP的Ano1在FRT细胞中的表达与定位;荧光淬灭动力学检测Ano1转运I^-的能力。结果显示,融合和未融合EGFP的Ano1均表达于FRT细胞膜上,且均能被Ca^(2+)激活,融合和未融合EGFP的Ano1转运I^-的能力无明显差异。以上结果提示,Ano1和EGFP-Ano1具有相似的生理特性。

尼氟灭酸抑制哮喘小鼠气道黏液高分泌

目的观察小鼠钙激活Cl-通道Ⅲ型(mCLCA3)阻断剂尼氟灭酸(NFA),对哮喘小鼠气道黏液高分泌的抑制作用。方法将BABL/c小鼠随机分为哮喘组、吸入NFA预防组和正常对照组。AB-PAS特染法检测各组小鼠小支气管杯状细胞的数量及黏液分泌状况。RT-PCR法检测各组肺组织中黏蛋白MUC5AC mRNA和mCLCA3 mRNA水平。结果正常对照组小支气管只有少量散在分布的杯状细胞,管腔干净;而哮喘组出现大量簇状分布的杯状细胞,胞质内富含着色颗粒,管腔具有着色黏液;NFA预防组的杯状细胞数量与正常对照组相近。哮喘组的MUC5AC及mCLCA3 mRNA水平均显著高于正常对照组、NFA预防组;NFA预防组的MUC5AC mRNA水平与正常对照组接近,而mCLCA3 mRNA水平稍高于正常对照组。结论NFA能有效抑制哮喘小鼠气道杯状细胞数量的增加及黏蛋白的合成,这一效果是通过阻断mCLCA3活性和降低其表达水平来实现的。

哮喘气道上皮杯状细胞合成GM-CSF及其调控机制的研究

目的 观察哮喘小鼠气道上皮杯状细胞合成粒细胞 /巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)的能力 ,探讨钙激活Cl-通道(CLCA)在合成中的调控作用。方法 取成年雄性BALB/c小鼠 ,采用卵蛋白致敏法制备哮喘模型。AB PAS特染法检测哮喘小鼠小支气管杯状细胞的分布 ;同一解剖部位采用免疫组化染色法检测GM CSF的表达。体外培养人气道黏液上皮细胞系NCI H2 92 ,采用含人hCLCA1的重组质粒pIRES2 EGFP/hCLCA1转染该细胞。筛选到稳定表达hCLCA1的细胞后 ,免疫组化法及RT PCR法检测该细胞GM CSF的表达、转录水平。设非转染细胞和CLCA阻断剂NFA干预的转染细胞为两个对照组。结果 哮喘小鼠气道杯状细胞GM CSF免疫组化染色为阳性。转染hCLCA1细胞的GM CSF表达与转录水平明显高于两个对照组 ;NFA能抑制转染细胞GM CSF的表达和转录。结论 哮喘气道上皮杯状细胞能合成GM CSF ,特定CLCA表达升高是促进GM CSF合成的机制之一。