皮质酮对原代培养的海马神经元及其[Ca^(2+)]_i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的影响

目的:探讨皮质酮(CORT)对培养的海马神经元及其[Ca2+]i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的影响和可能的机制。方法:海马神经元被分为不同终浓度的CORT处理组、CORT+MK-8 0 1或高浓度葡萄糖组。采用MTT法、流式细胞术、荧光标记和免疫细胞化学法,观察海马神经元活力、死亡方式[、Ca2+]i和CaMKⅡ表达的变化规律。结果:1 0-6和1 0-5mol/L CORT组,其海马神经元的活力明显降低,分别以凋亡和坏死为主,并使海马神经元[Ca2+]i显著升高;CaMKⅡ的表达明显减少。MK-8 0 1和高浓度葡萄糖均能拮抗1 0-6mol/L CORT对海马神经元的损伤作用。结论:在CORT的作用下,海马神经元发生凋亡和坏死;[Ca2+]i升高可能既是海马神经元损伤的结果,又是引起其发生凋亡和CaMKⅡ表达下降的原因。

心力衰竭家兔心肌细胞核及肌浆网钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的变化

目的:探讨家兔慢性心力衰竭(心衰)时心肌细胞核、肌浆网钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)蛋白表达及活性的改变。方法:16只家兔随机分为两组,假手术组、心衰组各8只,通过超容量负荷联合压力负荷建立家兔心衰模型,于术后7周观察左心室结构、血液动力学的变化及心肌细胞核、肌浆网CaMKⅡ的表达和活性的改变。结果:与假手术组比较,心衰组左心室重量指数[(132±0.06)g/kg vs(3.61±0.09)g/kg]、左心室舒张末压[(-1.50±0.50)mmHg vs(23.00±2.37)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)]显著升高(P均<0.05),左心室短轴缩短率(37.83%±3.58%vs 17.38%±3.13%)及左心室射血分数(71.92%±4.56%vs 38.50%±6.07%)明显降低(P均<0.05);心衰组心肌细胞核和肌浆网的CaMKⅡ蛋白表达及活性均显著高于假手术组(P均<0.05)。结论:心肌细胞核及肌浆网CaMKⅡ蛋白表达及活性增加可能是心衰发生的机制之一。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ参与多柔比星导致的心肌细胞毒性反应

目的:探讨钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)在多柔比星导致的心肌细胞毒性反应中的作用。方法:用多柔比星处理大鼠心肌细胞,检测细胞增殖情况、CaMKⅡδ基因的表达情况和活性变化。利用常间回文重复序列丛集(CRISPR)技术敲除大鼠心肌细胞CaMKⅡδ基因表达,检测CaMKⅡδ基因敲除后的大鼠心肌细胞对多柔比星诱导凋亡的应答变化。检测CaMKⅡδ基因敲除大鼠心肌细胞经多柔比星处理后核因子(NF)-κB活化的变化以及miR-146a表达情况的变化。结果:多柔比星处理抑制大鼠心肌细胞增殖,CaMKⅡδ基因的表达变化不明显,但活性显著上升。利用CRISPR技术可有效敲除CaMKⅡδ基因表达。敲除CaMKⅡδ基因后的大鼠心肌细胞对多柔比星的敏感度降低。相对于正常细胞,敲除CaMKⅡδ基因后的大鼠心肌细胞在多柔比星处理时NF-κB活化程度降低,miR-146a表达上调程度降低。结论:CaMKⅡδ参与多柔比星对心肌细胞的毒性作用,这一过程涉及NF-κB以及miR-146a。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在心血管疾病中的作用进展

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是许多心血管疾病的关键酶。CaMKⅡ能通过自身磷酸化、氧化、巯基亚硝基化和O-乙酰氨基葡萄糖修饰来调节多种细胞过程。许多研究表明,CaMKⅡ信号通路广泛影响心血管系统的生理活动,对于心律失常、心力衰竭及糖尿病心肌病等心血管疾病的发生发展发挥着重要的作用。本文收集了近年来对CaMKⅡ的组成结构和激活途径的研究,总结了CaMKⅡ信号通路对心血管疾病的调控作用,以及CaMKⅡ抑制剂和基因编辑对心血管疾病的治疗作用,为以后CaMKⅡ抑制剂药效及成药性的研究提供相关的理论依据及思路。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在心力衰竭与触发性心律失常中的信号转导作用

心力衰竭的心肌细胞可发生组织重构和电重构,尤其是细胞内钙离子循环出现障碍时,引起心脏电-机械活动异常,这也是其心律失常产生的主要原因。近年来研究表明,钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通过调节钙循环的各个环节,在心肌肥大和凋亡所致心电重构和心力衰竭的发生、发展中起着关键的信号转导作用,该文将近年来的研究进展扼要概述。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ与心力衰竭关系的研究进展

心力衰竭的发生发展过程中伴随钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性升高。心肌细胞内钙离子浓度的升高激活CaMKⅡ,CaMKⅡ通过钙离子超载、心肌细胞肥厚、线粒体功能障碍等途径影响心肌细胞功能,进而促进心力衰竭进展。抑制CaMKⅡ可缓解心力衰竭的进程,现有的小分子CaMKⅡ抑制剂对心肌细胞的特异性较差,尚不能应用于临床。中医药也可通过抑制CaMKⅡ控制心力衰竭症状,显示出良好的应用前景,但目前应用证据稍显不足,仍需进一步研究证实。现对CaMKⅡ的结构、影响心力衰竭的病理生理机制、CaMKⅡ抑制剂等方面进行综述,希望为心力衰竭的研究与治疗提供依据和思路。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅡδRNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响

目的研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ(Ca2+/Calmodulin dependent kinaseⅡδ,Ca MKⅡδ)RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响,以证实其在破骨细胞分化中的作用。方法应用慢病毒构建Ca MKⅡδRNA干扰载体,并确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值及转染效率。小鼠RAW264.7细胞分为对照组、空白载体组和干扰组。转染5 d后收获细胞,确定干扰效率;并检测RNA干扰对活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、非受体酪氨酸激酶(c-Src)基因表达及破骨细胞分化的影响。结果成功构建了Ca MKⅡδRNA干扰载体,最佳转染MOI值为30,转染效率可达78%(P<0.05)。重组病毒对Ca MKⅡδ的干扰效率在mRNA水平超过78%,在蛋白水平超过70%(P<0.01)。Ca MKⅡδRNA干扰显著降低NFATc1、TRAP和c-Src基因,与对照组、空白载体组比较,其mRNA水平下降分别超过了47.8%、43.3%和48.5%(P<0.05,P<0.01),蛋白相对水平分别超过了61.1%、48.2%和39.6%%(P<0.01);免疫荧光细胞化学检测也得到相似结果。Ca MKⅡδRNA干扰也显著降低了破骨细胞生成及骨吸收功能;与其他两组比较,干扰组破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数目和面积下降分别超过了49.8%、47.6%和61.3%(P<0.01)。结论 Ca MKⅡδRNA干扰可显著下调其下游NFATc1、TRAP、c-Src基因表达并抑制破骨细胞分化;Ca MKⅡδ在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用。

结直肠癌中钙离子钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ的表达及其意义

目的分析钙离子钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ体内外的表达情况并探讨其机制,为临床诊断治疗提供新的靶点。方法采用半定量RT-PCR技术检测3种人结直肠癌细胞系、20对结直肠癌组织及其配对癌旁组织中CAMKⅡδmRNA的表达水平;利用Western Blot技术及免疫组化SP技术检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中CAMKⅡδ蛋白的表达情况,并结合患者的临床病理参数进行分析。结果CAMKⅡδmRNA水平在3种结直肠癌细胞系中均有较高的表达,其中SW620表达最高,依次为HT-29、RKO。20对结直肠癌组织,有16对癌组织中CAMKⅡδmRNNA表达高于癌旁组织,其值分别是0.48±0.31和0.25±0.16,两者之间有统计学差异(P=0.002)。1 Western Blot的检测结果与RT-PCR的检测结果相一致,同样可以观察到CAMKⅡδ在配对的癌组织中的表达强于癌旁组织(P<0.05)。免疫组化提示CAMKⅡδ在结直肠癌组织中免疫反应强阳性,而癌旁正常组织中表达明显减弱。20例结直肠癌组织标本中,CAMKⅡδ的阳性表达率为55%(11/20),明显高于癌旁正常组织的表达率20%(4/20)。(P=0.022)结论 CAMKⅡδ在结直肠癌细胞系及结直肠癌组织中高表达,提示可能促进肿瘤细胞的不断增殖,与直肠癌的发生发展密切相关。

Ca^(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在心脏重构中作用的研究进展

Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ是一种分布广泛的多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与调节心脏的多种生理活动,如兴奋-收缩耦联和兴奋-转录耦联等生理过程;然而钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的持续过度表达会催化激活多种心脏靶蛋白,包括离子通道、Ca2+稳态蛋白、转录因子等,引起兴奋-收缩耦联、兴奋-转录耦联缺陷,提示钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ信号通路是促进心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的中心机制之一。现对近几年来这一领域的进展进行扼要综述。

钙调蛋白在钙通道钙依赖性易化与失活机制中的作用

电压门控钙通道受钙依赖性易化和失活两种相互对立的反馈机制的调节。研究表明此调节机制的失衡与心律失常等的发病机制密切相关。目前认为不同浓度的钙离子，通过作为钙感受器的钙调蛋白（calmodulin，CaM）的介导，分别引发钙依赖性易化和失活。然而，同一分子CaM如何介导易化和失活两个相对立的过程，其具体机制尚不明确。本研究采用膜片钳单通道的膜内向外记录技术观察了豚鼠心室肌L型钙通道的钙依赖性易化与失活过程，并观察了不同浓度的CaM和[Ca2＋]对此过程的影响。结果表明：在100nM[Ca2＋]下，CaM（0．1-14μM）对钙通道活性的影响呈先增高后降低的过程，浓度依赖性曲线为钟型，而不是S型。随着钙离子浓度的增加，此钟型曲线向左侧（即低CaM浓度侧）移动。然而，如果钙通道活性发生“run-down”现象而消失后，CaM对钙通道活性的“钟型”调节作用及钙依赖性易化与失活也同时消失。钙调蛋白激酶Ⅱ的存在可以使钙通道恢复对钙离子和CaM调节的感受性。上述结果提示钙通道钙依赖性易化与失活是一个复杂的过程，钙通道同时存在钙依赖性和CaM依赖性易化和失活过程，而这些过程是在钙通道磷酸化的基础上进行的。

六味地黄丸含药血清对KCl诱导PC12细胞内Ca^(2+)离子浓度及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响

目的:研究六味地黄丸含药血清对KCl诱导PC12细胞内Ca2+浓度及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)mRNA水平的影响。方法:取对数生长期的PC12细胞株(大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞株),经10%六味地黄丸含药血清预保护48 h后,加入150 mmol.L-1KCl刺激后,应用细胞活性检测(MTT法)观察细胞活性和应用激光共聚焦等技术方法观察六味地黄丸含药血清对PC12细胞Ca2+浓度变化的影响,RT-PCR法检测各组PC12细胞CaMKⅡmRNA表达水平。结果:10%六味地黄丸血清[细胞吸光度(A)为(1.15±0.09)]能显著提升细胞存活率,与模型组[细胞吸光度(A)为(0.47±0.11)]相比有显著性差异(P<0.01);PC12细胞经10%六味地黄丸血清预保护48 h后静息钙强度与空白对照组、模型组相比有显著性差异(P<0.05),150 mmol.L-1KCl刺激后,经10%六味地黄丸血清预保护48 h的细胞内Ca2+平均荧光强度明显低于模型组(P<0.05),同时细胞内CaMKⅡmRNA表达显著升高(P<0.05)。结论:六味地黄丸含药血清对KCl诱导PC12细胞内钙超载有抑制作用,且可提高细胞内CaMKⅡmRNA表达水平。

钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在非霍奇淋巴瘤中的功能和作用研究

目的 探讨钙离子-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在非霍奇淋巴瘤中的功能及作用机制。方法 人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞随机分为空白组、对照组、实验组和联合组。空白组给予RPMI1640培养基进行培养;对照组先给予pCaMKⅡshRNA-1和pCaMKⅡshRNA-2转染后,再给予RPMI1640培养基进行培养;实验组先给予pcDNA3.1/CaMKⅡ真核表达质转染后,再给予RPMI1640培养基培养;联合组先用pcDNA3.1/CaMKⅡ真核表达质粒转染后,再给予含20μmol·L^(-1)SP600125的RPMI1640培养基进行培养。干预48 h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用Western blot法检测淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、磷酸化即刻早期原癌基因(p-c-Jun)和磷酸酸化c-Jun N末端激酶(p-JNK)蛋白的表达情况。结果 干预48 h后,实验组、对照组、联合组和空白组的细胞凋亡率分别为(29.57±4.38)%,(5.23±0.89)%,(21.24±0.97)%和(11.85±1.24)%,Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.38±0.08,1.92±0.13,1.39±0.09和1.13±0.09,p-c-Jun蛋白相对表达量分别为1.06±0.08,0.14±0.05,0.71±0.09和0.58±0.06,p-JNK蛋白相对表达量分别为1.53±0.12,0.28±0.06,1.05±0.09和0.83±0.08。实验组的上述指标与对照组和联合组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 CaMKⅡ可能通过激活JNK途径,从而诱导Raji细胞凋亡。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ与心律失常及心力衰竭的研究进展

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它能通过调节离子通道和钙转运参与心肌细胞的心电活动。研究表明,CaMKⅡ是心律失常的关键酶,当其活性增高,通过影响相关离子通道,导致心房颤动、长QT综合征、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速等各种心律失常和心力衰竭;抑制CaMKⅡ活性能减少心律失常的发生,因此,CaMKⅡ是潜在的新型抗心律失常药物靶点。

小鼠中缝背核向屏状核投射神经通路的形态学特征

目的探索小鼠中缝背核(DRN)向屏状核(CLA)投射神经通路的形态学特征。方法分别将逆行示踪剂594 retrobeads和顺行示踪剂生物素化的葡聚糖胺(BDA)注入CLA(n=3)和DRN(n=3),结合5-羟色胺(5-HT)免疫荧光染色,观察逆行标记神经元的分布和神经化学特征以及顺标神经纤维和终末在全脑和CLA内的分布;利用钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-Cre、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)-Cre动物结合狂犬逆行跨突触病毒(RV)标记,观察DRN-CLA通路的下游靶神经元类型。结果DRN的吻、中、尾段均能观察到594 retrobeads阳性神经元的胞体,中段的腹侧亚核(DRV)分布较多,且90%以上的逆行标记神经元为5-HT阳性。BDA顺标纤维密集分布于腹侧被盖区、束旁核、腹侧苍白球、杏仁中央核等区,CLA内的神经纤维和终末相对稀疏。RV跨突触逆行标记结果显示,CaMKⅡ-Cre动物的DRN中含有较多的突触前神经元,而GAD67-Cre动物DRN中突触前逆行标记神经元较少。结论DRN-CLA通路是以DRV分布为主的5-HT能投射通路,其在CLA内的纤维和终末较为稀疏,主要与CLA内的CaMKⅡ阳性神经元形成突触联系。

低浓度铅对大鼠脑组织CaMKⅡ mRNA及其蛋白表达的影响及驱铅丸的干预作用

目的探讨低浓度铅对大鼠脑组织钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的影响及中药驱铅丸的干预作用。方法 40只大鼠随机分为5组:对照组、模型组、中药高、低剂量组、依地酸钠钙(EDTA)组。除对照组外,其他4组饮水中均添加0.02%醋酸铅,中药高、低剂量组分别按每日3.5g/kg和2.0g/kg的剂量灌服驱铅丸,EDTA组以每日EDTA加普鲁卡因按50.0mg/kg肌肉注射。60d后,检测全血、脑组织铅含量,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组织化学法检测脑组织CaMKⅡ mRNA及其蛋白表达。结果与对照组比较,模型组血铅、脑铅含量显著增高(P<0.01),脑组织CaMKⅡ mRNA及其蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,驱铅丸高剂量组脑铅、血铅含量显著降低(P<0.05),脑组织CaMKⅡ mRNA及其蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论驱铅丸可降低铅中毒大鼠血铅、脑组织铅含量,其机制与增加脑组织CaMKⅡmRNA及其蛋白表达等有关。

生姜提取物对染铝毒大鼠学习记忆功能和神经细胞结构的影响及其可能作用机制

目的分析生姜提取物(GRE)对铝染毒大鼠学习记忆功能及神经细胞结构的影响,并基于钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、蛋白激酶C(PKC)探讨其可能的作用机制。方法将36只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、铝染毒组、临床药物组、低剂量GRE(L⁃GRE)组、中剂量GRE(M⁃GRE)组、高剂量GRE(H⁃GRE)组,每组6只大鼠。空白对照组大鼠自由饮用不含氯化铝的饮用水,其余组大鼠饮用含10 mg/mL结晶氯化铝的饮用水。3个月后给予空白对照组和铝染毒组大鼠灌胃生理盐水,临床药物组大鼠灌胃盐酸多奈哌齐溶液,分别给予L⁃GRE组、M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠灌胃100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg GRE溶液。持续干预4周后,采用Morris水迷宫实验评估大鼠的学习记忆功能,通过HE染色观察大鼠海马组织形态变化,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测大鼠海马组织CaMKⅡ、nNOS、PKC mRNA和蛋白表达水平。结果(1)与空白对照组相比,铝染毒组大鼠的逃避潜伏期延长且穿越平台次数减少(P<0.05),海马组织的神经细胞皱缩,神经细胞数量明显减少,CaMKⅡ、nNOS、PKC的mRNA表达水平及nNOS、PKC的蛋白表达水平降低(P<0.05)。(2)与铝染毒组比,L⁃GRE组、M⁃GRE组和H⁃GRE组大鼠的逃避潜伏期缩短,临床药物组、M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠的穿越平台次数增加(P<0.05);各给药组大鼠海马组织病理形态有不同程度的改善;临床药物组大鼠的CaMKⅡ、nNOS和PKC mRNA表达水平升高,各剂量GRE组大鼠nNOS和PKC mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。(3)与临床药物组相比,M⁃GRE组和H⁃GRE组大鼠的逃避潜伏期,以及各剂量GRE组的穿越平台次数和目标象限停留时间差异无统计学意义(P>0.05);各剂量GRE组大鼠海马组织病理形态改善程度更为明显;M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠的nNOS、PKC蛋白表达水平升高,L⁃GRE组大鼠的nNOS蛋白表达水平升高(P<0.05)。(4)各剂量GRE组组间大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及目标象限停留时间差异无统计意义(P>0.05);随GRE干预剂量增加,大鼠海马组织病理形态的改善效果越明显;H⁃GRE组大鼠的CaMKⅡmRNA表达水平高于L⁃GRE组(P<0.05)。结论GRE能够改善铝染毒大鼠的神经细胞结构和学习记忆功能,其中对神经细胞结构的改善效果优于盐酸多奈哌齐,对学习功能的改善效果与盐酸多奈哌齐相当。GRE的作用机制可能与拮抗铝所致CaMKⅡ、nNOS和PKC表达水平下降有关。

IP3R1调控CaMKⅡ和VDAC1在海洛因致心肌细胞节律异常中的作用

目的:探讨1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,IP3R1)调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)在海洛因(heroin,HE)致心肌细胞节律异常中的作用。方法:联合蛋白组学和GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析心律失常芯片数据,寻找关键调控因子。构建IP3R1基因敲减慢病毒并感染原代乳大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs),实验分为对照(control)组、HE组和HE+shIP3R1组。结晶紫染色观察心肌细胞形态;ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平;透射电镜观察线粒体形态学变化;Fluo-4/AM探针法检测细胞内Ca^(2+)浓度;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;免疫共沉淀(co-immunopre-cipitation,Co-IP)分析IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1蛋白之间的相互作用;Western blot检测IP3R1、CaMKⅡδ、p-CaM-KⅡδ(T287)和VDAC1的蛋白水平。结果:结合蛋白质组学和基因表达谱数据集GSE89410分析,筛选得到80个差异共表达分子,基于基因本体论(Gene Ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析结果,最终筛选出关键因子IP3R1,且通过STRING数据库获得IP3R1结合蛋白:CaMKⅡδ和VDAC1。Co-IP结果验证IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1存在相互作用,且HE干预后NRCMs中IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1之间的相互作用增强。体外细胞实验显示,与control组相比,HE组NRCMs数量急剧减少,细胞膜变窄,伪足减少,细胞核结构模糊;LDH和AST水平均显著上升(P<0.05);线粒体超微结构损伤严重,证实HE对NRCMs具有毒性作用并导致线粒体损伤。与control组相比,HE组心肌细胞内Ca^(2+)浓度、ROS水平、MMP以及IP3R1、p-CaMKⅡδ(T287)和VDAC1蛋白水平均显著升高(P<0.05),而HE+shIP3R1组这些指标均显著减低(P<0.05);ATP水平则相反。这证实沉默IP3R1表达可减轻HE干预后NRCMs的钙超载及线粒体损伤。结论:IP3R1通过调控CaMKⅡ和VDAC1引起心肌细胞钙超载和ROS生成增多,参与HE诱导的心肌细胞节律异常。

CaMKⅡ_γ通过上调NFκB信号通路促进结直肠癌细胞的增殖

目的研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)体内外促进结直肠癌细胞增殖的作用并探讨其机制。方法半定量RT-PCR法测定5种结直肠癌细胞系及20对结直肠癌组织及其配对癌旁组织中CaMKⅡγmRNA表达水平。用慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-eGFP制备慢病毒颗粒Lenti-CaMKⅡγ,转染SW620细胞,建立稳定表达CaMKⅡγ结直肠癌细胞系SW620-CaMKⅡγ。测定SW620-CaMKⅡγ细胞的生长曲线及克隆形成能力。Western blotting检测SW620-CaMKⅡγ细胞IKKα、IKKβ、IKKγ、p-IKKα/β、P-IκB和IκB表达水平。免疫荧光检测SW620-CaMKⅡγ细胞NF-κB p65核浆及核内的表达情况。检测裸鼠移植瘤的瘤体积。结果 CaMKⅡγ在5种结直肠癌细胞系中的mRNA水平均高,在20对组织中有18对癌组织mRNA水平比癌旁组织高。慢病毒转染的CaMKⅡγ过表达细胞系增殖能力增强(P<0.05)。CaMKⅡγ能够激活细胞内的NF-κB信号通路,促进NF-κ3 p65进核。CaMKⅡγ过表达细胞的裸鼠移植瘤瘤体积大于阴性对照(P<0.05)。结论 CaMKⅡγ体内外均能促进结直肠癌细胞的增殖,并激活NF-κB通路。

别孕烯醇酮对帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经元的影响及可能的分子机制

目的探讨别孕烯醇酮(APα)对帕金森病(PD)小鼠黑质-纹状体多巴胺能系统及行为学的影响及可能的分子机制。方法90只3月龄体重为20~25 g雄性C57BL/6小鼠1侧纹状体被注射6-羟多巴胺(6-OHDA)复制小鼠PD模型,再给予APα及γ-氨基丁酸A受体(GABAAR)拮抗剂荷包牡丹碱(Bic)。采用ELISA检测血清及大脑皮质APα含量和纹状体多巴胺水平,免疫组织化学法检测黑质多巴胺能神经元及其纹状体纤维投射数量的变化,Western blotting检测中脑胞膜GABAAR、胞质及胞核各蛋白水平的变化,并通过免疫共沉淀验证它们之间的相互作用,观察小鼠行为学的变化。结果PD小鼠大脑皮质内源性APα水平显著降低,黑质多巴胺能阳性神经元及其纹状体纤维投射含量下降,胞膜、胞质和胞核各蛋白的水平也明显下降,小鼠的运动功能发生障碍。在给予外源性APα处理后,上述情况均有所改善。但在应用Bic后,上述调控GABAAR/钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ3/脑源性神经营养因子信号呈现相反的变化,免疫共沉淀结果显示,蛋白之间存在相互作用。结论外源性的APα通过增加其内源性水平调控GABAAR/钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ3/脑源性神经营养因子信号通路促进PD模型小鼠黑质-纹状体多巴胺能神经系统和小鼠行为学的改善。

氟对原代培养大鼠海马神经元一氧化氮和钙及钙调激酶的影响

目的探讨氟对原代培养海马神经元中NO含量、钙离子水平及磷酸化钙调蛋白激酶蛋白表达水平的影响。方法将原代培养的新生SPF级SD大鼠海马神经元分别暴露于含终浓度为0(对照)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L氟化钠的培养基中,于37℃、5%CO_2培养箱中继续培养6、12、24 h。检测海马神经元的活性、NOS活力、NO含量及海马神经元中钙离子水平、磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ(pCaMKⅡ)蛋白的表达水平。结果与对照组比较,0.4、0.8、1.6 mg/L NaF染毒6、12、24 h大鼠海马神经元的细胞存活率均较低,而NOS的活力和NO的含量以及钙离子的水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与染毒6 h比较,仅0.4、0.8、1.6 mg/L NaF染毒24 h大鼠海马神经元的细胞存活率均较低,而NOS的活力和NO的含量以及钙离子的水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,0.4、0.8、1.6 mg/L Na F染毒6 h及0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L Na F染毒12、24 h大鼠海马神经元中pCaMKⅡ蛋白的表达水平均较高,差异有统计学意义(P<0.05);与染毒6 h比较,不同浓度Na F染毒12、24 h大鼠海马神经元中pCaMKⅡ蛋白的表达水平均较高,差异有统计学意义(P<0.05)。随着氟染毒浓度的升高和染毒时间的延长,原代培养大鼠海马神经元的存活率呈下降趋势,而NOS的活力、NO的含量和钙离子的水平及pCaMKⅡ蛋白的表达水平均呈上升趋势。结论氟对中枢神经系统的损伤可能是通过增加信号转导通路中重要的第二信使以及神经递质表达所致。