科学家开发出检测酪氨酸磷酸化新方法

近日,中国科学院大连化学物理研究所研究员卿光焱与梁鑫淼合作,在蛋白质磷酸化研究方面取得新进展,开发出一种智能聚合物功能化的仿生离子通道器件,实现了酪氨酸磷酸化的实时感知与测量,并在酪氨酸激酶抑制剂筛选中展现出较好的应用潜力。相关成果发表在《美国化学会志》上。蛋白酪氨酸磷酸化是一种关键的细胞活动调节机制,异常的酪氨酸磷酸化与多种癌症的发生密切相关。

在非刺激条件下TRPC6的814位点丝氨酸磷酸化

TRPC（瞬时受体电位阳离子通道）是与钙离子内流有关的非选择性阳离子通道。其通过磷酸化实现对通路和活性的调节。其中，TRPC6在肾脏中主要定位于足细胞上，对足细胞内钙离子浓度的调节发挥重要作用。TRPC6可以由Fyn激酶（Src家族中的一种酪氨酸激酶）磷酸化。实验证实Fyn激酶磷酸化TRPC6后可以使TRPC6活性增加，这一现象可以被TRPC6的Thr^99位的蛋白激酶G和ser^448位的蛋白激酶C抑制。已有研究指出，TRPC6在非刺激条件下的人胚胎肾细胞系（HEK293）中可以发生基本磷酸化，

载脂蛋白A1抗体通过抑制Ca^(2+)载体A23187诱导的Ca^(2+)内流降低精子活力

目的 分析载脂蛋白A1(apo A1)抗体对Ca^(2+)载体A23187诱导的精子Ca^(2+)内流的影响,探讨apo A1抗体与精子活力的关系。方法 收集健康男性精液样本38份。采用免疫荧光法观察apo A1在人精子中的定位和apo A1抗体对精子顶体反应的影响。采用免疫印迹法检测精子获能相关蛋白酪氨酸磷酸化情况。分别采用正常兔Ig G(正常兔Ig G组)和40μg·m L^(-1) apo A1抗体(apo A1抗体组)处理样本,以正常精液样本作为空白对照组,比较各组精子总活力和前向运动精子百分率差异。分别采用正常兔Ig G和10、20、40μg·m L^(-1) apo A1抗体处理Fluo-4AM负载的精子样本,以未作处理的Fluo-4AM负载的精子样本作为空白对照,采用10μmol·L^(-1) A23187诱导30 min,采用流式细胞术检测精子内Ca^(2+)水平。结果 apo A1蛋白定位于人精子头部。apo A1抗体组精子总活力和前向运动精子百分率均显著低于空白对照组和正常兔Ig G组(P<0.001),空白对照组与正常兔Ig G组之间2项指标差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞术结果显示,A23187诱导后,精子内Ca^(2+)荧光强度升高;采用apo A1抗体处理后,Ca^(2+)浓度显著降低(P<0.01),且呈剂量依赖性。40μg·m L^(-1) apo A1抗体+A23187组顶体反应率显著低于A23187组和正常兔Ig G+A23187组(P<0.001),且apo A1抗体对精子自发顶体反应无影响。免疫印迹法结果显示,apo A1抗体处理前后精子的蛋白酪氨酸磷酸化无显著变化。结论 apo A1抗体可以通过降低Ca^(2+)内流使精子活力下降,并抑制Ca^(2+)载体A23187诱导的顶体反应。

钙离子结合酪氨酸磷酸化调解基因的特征及在肿瘤发病中的意义

目的总结钙离子结合酪氨酸磷酸化调解基因的特征及其在肿瘤发病中的意义。方法通过复习国内外文献,回顾分析钙离子结合酪氨酸磷酸化调解基因参与调节的信号通路及其在多种肿瘤中的研究现状。结果钙离子结合酪氨酸磷酸化调解基因通过多种机理诱导细胞增殖异常,多种肿瘤的发生与钙离子结合酪氨酸磷酸化调解基因的异常表达密切相关。在分布不同的上皮性肿瘤中,钙离子结合酪氨酸磷酸化调解基因参与调节的通路相同,作用靶点相似。结论钙离子结合酪氨酸磷酸化调解基因的进一步深入研究有望为阐明肿瘤的发生、发展机理提供新的途径,并且可以作为早期诊断及辅助治疗的重要手段。

人精子纤维鞘多态性蛋白CABYR的寡聚化作用

目的验证钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白（calcium-binding tyrosine phosphorylation-regulated protein,CABYR）不同异构体之间寡聚体的形成。方法人精子提取物进行非还原和还原条件下的SDS-PAGE、二维IEF/SDS-PAGE、对角线电泳、二维blue native/SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。结果在人精子中丰度最高的CABYR亚型是相对分子质量86×103仅含CRA编码区表达序列,具有钙结合能力的异构体。同时也存在既含CRA又含CRB编码区表达序列的CABYR亚型。在非还原条件下,丰度最高的130×103二聚体是由仅含CRA表达序列的86×103异构体和既含CRA又含CRB表达序列的50×103异构体组成。（200-220）×103寡聚体是由86×103、50×103异构体,以及35×103（可能既含CRA又含CRB表达序列）的异构体和仅含CRA表达序列的30×103异构体组成。结论证实CABYR异构体可形成寡聚体,CABYR主要通过86×103和50×103异构体形成异质二聚体,与其他CABYR异构体结合进一步形成更大的寡聚体,参与了人精子纤维鞘超分子结构的装配和形成。

骨质疏松分子生物学研究专家共识

骨质疏松分子生物学研究在骨代谢分子信号通路、骨质疏松易感基因、骨质疏松相关蛋白、骨质疏松靶向治疗等方向取得了很大进展。核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素(RANK/RANKL/OPG)信号通路、核因子κB受体活化因子(NF-κB)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)信号通路、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)信号通路、钙离子(Ca^(2+))信号通路、酪氨酸激酶、蛋白激酶B(Src、Akt)信号通路、蛋白激酶C(PKC)信号通路等骨代谢重要通路,维生素D受体(VDR)基因、低密度脂蛋白相关蛋白5(LRP5)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因、雌激素受体(ER)基因等易感基因,载脂蛋白E(Apo E)、Klotho蛋白(Klotho)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨涎蛋白(BSP)等相关蛋白,以直接或间接的方式参与调控骨代谢,作用重叠相互联系,互为结果,已在本专业领域达成共识。

电压依赖性钙通道的活化激动生长因子受体信号传导

电压依赖性钙通道的活化激动生长因子受体信号传导［英］Ｌ．Ｂ．Ｒｏｓｅｎ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｌＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９６；９３（３）：１１１３～１１１８为了探讨电活动引起的神经系统长反应机制，作者对申压依赖性钙通道的活化与其促活化蛋白激酶的信号传...

非小细胞肺癌患者组织及外周血中CABYR的表达及意义

目的检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌组织和外周血中钙离子结合酪氨酸磷酸化调节蛋白(CABYR)的表达水平,探讨CABYR作为非小细胞肺癌患者肿瘤标志物的临床意义。方法收集NSCLC患者肿瘤组织及其对应癌旁组织、肺癌患者和正常人外周血,同时收集食道癌患者肿瘤组织及其对应癌旁组织作为其他肿瘤对照,用实时荧光定量PCR检测肺癌组织和外周血中CABYR-a/b mRNA的表达;用免疫组织化学法(IHC)检测肺癌组织及其对应癌旁组织中CABYR的表达水平。结果免疫组化证实NSCLC组织中有CABYR的表达;恶性与癌旁组织CABYR-a/b相对表达比值大于1的患者,在NSCLC患者肿瘤组织中CABYR-a/b mRNA的表达率(58.33%)明显高于食道癌组织(12.5%);与正常人外周血相比,NSCLC患者外周血中CABYR-a/b mRNA的表达水平略上调,但无统计学意义(P>0.05);与293T细胞株比较,CABYR-a/b在肺癌细胞株A549和H1650中的表达显著增高(P<0.01)。结论CABYR在NSCLC患者肿瘤组织和外周血中的表达均上调,对NSCLC的诊断和免疫治疗具有一定的临床价值,可能作为NSCLC的生物标志物,为非小细胞肺癌的免疫治疗提供一个新的靶点。

头痛宁胶囊对偏头痛大鼠BDNF/TrkB信号通路表达的影响

目的观察头痛宁胶囊对偏头痛大鼠模型中脑源性神经营养因子(BDNF)及其信号通路上酪氨酸激酶(TrkB)受体、下游信号分子细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化cAMP反应结合蛋白(p-CREB)表达的影响。方法将60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、头痛宁干预组,依照Tassorelli法建立硝酸甘油实验性偏头痛SD大鼠模型,观察各组大鼠的行为学变化,第五次建模后用ELISA法检测血清BDNF水平及免疫组化法检测三叉神经组织中BDNF、TrkB受体、下游信号分子ERK和p-CREB的蛋白表达变化及其定位。结果行为学观察结果显示:模型组及干预组大鼠造模后出现挠头增多、双耳发红、爬笼活动频繁,但干预组大鼠的持续时间及挠头爬笼次数较模型组减少,差异具有统计学意义(P<0.05);对照组未出现上述行为学改变。ELISA结果显示:模型组大鼠发作期及间歇期血清BDNF水平高于干预组发作期及间歇期和对照组(P<0.05),无性别差异(P>0.05)。免疫组化结果显示:模型组大鼠发作期三叉神经节细胞内BDNF、TrkB、p-ERK、p-CREB的蛋白水平高于干预组发作期及间歇期和对照组(P<0.05),无性别差异(P>0.05)。结论头痛宁胶囊可能通过下调BDNF、TrkB、p-ERK、p-CREB蛋白的表达水平来达到防治偏头痛的作用。

Dyrk1A经ASF调控CaMKⅡδ可变剪接在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用

目的:探讨双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(Dyrk1A)经可变剪接因子(ASF)对钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)可变剪接的调控在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用。方法:制备两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型,给予Dyrk1A抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和哈尔碱(harmine)干预,观察大鼠血压及心肌肥厚程度变化,逆转录-多聚酶链反应法检测CaMKⅡδ可变剪接的改变,免疫印迹法检测大鼠心肌Dyrk1A和ASF蛋白质表达的变化。结果:两肾一夹术后8周,与假手术组相比,手术组大鼠血压显著升高(P<0.05),大鼠左室重、左室重/体重比值及心肌细胞面积均增高(P<0.05),同时该组大鼠心肌中Dyrk1A蛋白表达增加,ASF蛋白表达下降(P<0.05),CaMKⅡδ亚型可变剪接表现为CaMKⅡδA、δB mRNA表达升高,δC mRNA表达降低(P<0.05);与手术组相比,EGCG和哈尔碱组大鼠左室重、左室重/体重比值和心肌细胞面积下降,同时大鼠心肌中Dyrk1A蛋白表达降低,ASF蛋白表达上调,CaMKⅡδ亚型可变剪接逆转(均P<0.05)。结论:Dyrk1A可通过ASF调控CaMKⅡδ的可变剪接,从而参与肾血管性高血压大鼠心肌肥厚的发生。

LncRNA00067110通过靶向Cabyr调控B16-F10细胞增殖、凋亡和黑色素生成

长非编码RNA(lncRNA)是一类转录长度大于200个核苷酸的非编码RNA。现已证明,多个lncRNA是潜在的癌症治疗靶点。LncRNA00067110是从小鼠黑色素瘤B16-F10细胞和正常黑色素细胞转录物组图谱中发现的差异表达基因。为研究lncRNA00067110是否调控B16-F10细胞的增殖、凋亡和黑色素生成,本文通过LncTar预测和双荧光酶活性验证了钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白(Cabyr)和lncRNA00067110存在靶向关系。通过构建lncRNA00067110的过表达载体,转染B16-F10细胞,经过对B16-F10细胞的转录图谱分析,并对细胞增殖、凋亡和黑色素生成的表型以及相关基因表达变化进行了检测。结果显示,lncRNA00067110靶向Cabyr,在过表达lncRNA00067110的B16细胞中,17个基因呈差异表达。其中,Cabyr的表达被上调,细胞增殖相关基因MEK/ERK/MNK/CREB和黑色素生成相关基因TYR家族成员及CREB的mRNA和蛋白质水平显著被下调,凋亡相关基因AKT和Bcl-2的mRNA水平和蛋白质丰度被上调。进一步通过细胞增殖和凋亡的表型的变化验证了lncRNA00067110的功能。结果提示,lncRNA00067110通过靶向Cabyr,调控相关基因表达,从而抑制B16-F10细胞的增殖和黑色素生成,并诱导黑色素瘤细胞的凋亡,可能成为治疗和抑制黑色素瘤的新的靶点。

cDNA-RDA技术分离新的肝硬化相关基因片段

目的 :分离在肝硬化组织上调表达的新基因 ,以阐述肝硬化发生的分子机制。方法 :利用优化的代表性差异分析方法分析正常肝脏及肝硬化组织表达基因的差异。两轮杂交后的产物克隆到T载体中 ,斑点杂交筛选阳性克隆以获得差异表达基因片段 ,并进一步以半定量RT PCR鉴定。结果 :上调表达的克隆包括与一些序列和功能完全未知的基因同源的cDNA以及未曾报道过的在肝脏病变中发生表达变化的已知基因———钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白、雌激素应答B盒蛋白等。结论 :利用优化的代表性差异分析方法成功分离获得在肝硬化组织中上调表达的基因片段 ,其中一些新基因的克隆及其在肝硬化发生中的作用有待进一步研究。

ZK 93426对小鼠和人精子获能的影响研究

目的探究小分子化合物ZK 93426对小鼠和人精子获能的影响及作用机制。方法采用蛋白质印迹技术(Western Blot)检测ZK 93426对小鼠精子和人精子获能相关的酪氨酸磷酸化的影响;运用Western Blot检测ZK 93426在正常以及缺少HCO3^-,BSA,Ca^2+的获能缓冲液(modified Krebs-Ringer bicarbonate medium,HMB)中对获能的作用;选取精子特异钙离子通道CatSper抑制剂NNC 55-0396及PKA通路抑制剂H89进一步探索ZK 93426对于精子获能的机制。结果 ZK 93426对小鼠精子和人精子获能相关蛋白酪氨酸磷酸化均有促进作用,且在缺少Ca^2+的获能缓冲液中具有更明显的促进蛋白酪氨酸磷酸化作用。NNC 55-0396不会抑制ZK 93426对于获能相关的酪氨酸磷酸化的促进作用,而PKA抑制剂H89可抑制其作用。结论 ZK 93426对精子获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化的促进作用不依赖CatSper通道,可能通过作用于PKA通路的上游发挥相应的作用。