细胞钙离子转运蛋白在动脉粥样硬化易损斑块形成中的作用

作为冠心病的重要始动因素,动脉粥样硬化是以血管内皮损伤为基础的多种危险因素综合作用的结果,主要涉及血管重塑及易损斑块形成。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell VSMC）增殖与凋亡是决定动脉粥样硬化斑块发生、发展的重要环节。已知细胞内Ca2＋参与了细胞增殖和凋亡的过程，而VSMC内Ca^2＋稳态的维持受细胞离子泵的调控。研究表明，血管受损时，例如动脉粥样硬化，VSMC从静止的收缩表型转化为增殖分泌表型，伴随着细胞内Ca^2＋及调节其转运的蛋白的改变，这些蛋白的改变在VSMC凋亡中发挥着至关重要的作用。1．血管平滑肌细胞凋亡促进动脉粥样硬化易损斑块形成动脉粥样硬化斑块形成以内皮功能紊乱为病理学特征，主要涉及多种危险因子对血管内皮损伤、源于血管平滑肌细胞和巨噬细胞的泡沫细胞沉着入内皮间隙以及血管平滑肌细胞增殖迁移等，终致纤维脂质斑块形成。

风湿性心脏病心肌细胞内钙离子转运蛋白基因转录的变化

目的：探讨风湿性心脏病（风心病）慢性心衰时心肌细胞内Ｃａ２＋转运功能改变的分子机制。方法：应用斑点杂交方法测定１２例风心病患者心肌细胞内４种主要Ｃａ２＋转运蛋白：Ｌ－型钙通道（ＤＨＰＲ）α１亚基、钠钙交换体（ＮＣＥ）、肌浆网钙泵（ＳＥＲＣＡ２）和肌浆网Ｃａ２＋释放通道－兰尼碱受体（ＲｙＲ２）的基因转录变化。结果：风心病患者ＤＨＰＲα１、ＳＥＲＣＡ２和ＲｙＲ２ｍＲ－ＮＡ水平，以鸡磷酸－３－甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ为内对照，分别较正常对照显著下降１２．５％，３１．６％和１３．０％，以β－肌球蛋白重链（ＭＨＣ）ｍＲＮＡ为内对照，则比正常对照分别显著下降８．９％、２２．０％和９．０％；而ＮＣＥｍＲＮＡ水平在两种内对照情况下分别显著升高５６．０％和４１．５％。结论：风心病慢性心衰时心肌细胞内Ｃａ２＋转运功能改变的机制很可能主要在转录水平。

下丘脑背内侧核线粒体钙离子单向转运蛋白参与小鼠慢性炎性痛调控的研究

目的探讨下丘脑背内侧核(DMH)在慢性炎性疼痛中的作用,对其中的线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)是否参与疼痛调节进行研究。方法采用雄性C56BL/6小鼠,左脚掌注射完全弗氏佐剂(CFA)或生理盐水造模,3 d后取材进行MCU及c-Fos的免疫荧光染色;在疼痛早期(造模后3 d)和疼痛晚期(造模后14 d)双侧DMH给予MCU激动剂(精胺),给药60 min后进行焦虑行为和/或疼痛行为测试。结果CFA慢性炎性痛显著激活DMH脑区神经元(P<0.01),然而MCU表达并未明显增加。更为有趣的是,激活MCU可显著增加CFA小鼠静态机械性缩足反射阈值与动态机械性缩足评分(P<0.01),短时间内缓解焦虑情绪(P<0.05,P<0.01)。结论DMH参与慢性炎性痛及其相关焦虑情绪的调控。在DMH脑区外源性给予MCU特异性激动剂精胺可显著缓解慢性炎性痛,这可能与MCU特有的胞内钙离子低阈值关闭特性相关。

线粒体钙离子单向转运蛋白与缺血再灌注损伤

缺血性休克、心脏骤停或切除与移植手术等会造成缺血再灌注损伤,其机制与钙离子超载密切相关。线粒体钙离子单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是位于线粒体内膜的高选择性钙离子通道,介导钙离子进入线粒体基质,以其为核心的MCU复合体对维持钙离子稳态,减轻心、肾、脑、肝等器官缺血再灌注损伤起重要作用,线粒体相关内质网膜是此过程的关键蛋白。

阿魏酸对糖尿病小鼠视网膜和高糖诱导的人RPE细胞损伤的抑制作用及其机制

目的探讨阿魏酸对糖尿病小鼠视网膜和高糖诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤的抑制作用及其机制。方法选取SPF级雄性8周龄2型糖尿病db/db小鼠30只,采用随机数字表法将小鼠分为模型组和阿魏酸组,每组15只,另选取15只同周龄db/m小鼠作为对照组。模型组和对照组每日采用生理盐水灌胃(5 ml/kg),阿魏酸组采用阿魏酸溶液灌胃(0.05 g/kg),治疗后2个月处死各组小鼠并摘除眼球。采用苏木精-伊红染色观察小鼠视网膜组织形态学变化;采用免疫荧光染色法和Western blot法检测各组小鼠视网膜组织线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)蛋白荧光强度和表达水平。取人RPE细胞,将其分为对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、高糖组和高糖+阿魏酸组,其中对照组不做任何处理,其余各组用相应试剂培养24 h。采用活性氧簇(ROS)检测试剂盒检测各组RPE细胞ROS水平;采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测各组RPE细胞线粒体膜电位水平;采用微丝绿色荧光探针检测各组RPE细胞MCU和微丝荧光强度;通过慢病毒转染技术沉默和过表达MCU蛋白水平探讨MCU与p38 MAPK、p-p38MAPK间的调控关系;采用免疫荧光染色法和Western blot法检测各组RPE细胞MCU、p38 MAPK、p-p38MAPK蛋白荧光强度和表达水平。结果与对照组比较,模型组小鼠视网膜组织外核层、内核层和神经节细胞层细胞间隙增大、排列紊乱,阿魏酸组小鼠视网膜组织明显改善。与对照组比较,模型组、阿魏酸组小鼠视网膜组织MCU、p-p38 MAPK和MCU+p-p38 MAPK蛋白荧光强度显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,阿魏酸组小鼠视网膜组织MCU、p-p38 MAPK和MCU+p-p38 MAPK蛋白荧光强度显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠视网膜组织MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,阿魏酸组小鼠视网膜组织MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。对照组、DMSO组、高糖组和高糖+阿魏酸组细胞ROS荧光强度分别为0.22±0.02、0.22±0.03、0.30±0.02和0.24±0.02,总体比较差异均有统计学意义(F=7.845,P<0.01),其中高糖组细胞ROS荧光强度明显高于对照组和DMSO组,高糖+阿魏酸组细胞ROS荧光强度明显低于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组、高糖+阿魏酸组细胞线粒体膜电位水平明显低于对照组和DMSO组,高糖+阿魏酸组细胞线粒体膜电位水平明显高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组、DMSO组比较,高糖组MCU荧光强度较高,并伴随着细胞微丝减少和变细;高糖+阿魏酸组MCU蛋白荧光强度明显下降,细胞微丝数量明显增加。与对照组、DMSO组比较,高糖组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白荧光强度和相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,高糖+阿魏酸组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白荧光强度和相对表达量显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组和空载体组比较,MCU过表达组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著升高,MCU shRNA组、MCU过表达+阿魏酸组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与MCU过表达组比较,MCU shRNA组、MCU过表达+阿魏酸组细胞MCU、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白相对表达量显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论阿魏酸能够调控氧化应激和线粒体功能障碍,进而改善糖尿病小鼠视网膜和高糖诱导的RPE细胞损伤,其可能通过MCU及p38MAPK信号通路发挥保护作用。

大鼠在体心肌缺血再灌注损伤细胞膜钙转运通道蛋白mRNA的表达变化

目的 探讨大鼠心肌在体缺血再灌注（IR）损伤后细胞膜钙转运通道蛋白的mRNA变化对钙超载的作用。方法 12只SD大鼠按随机数字法分为IR组和对照组。IR组通过结扎（缺血20 min）后松解（再灌注60 min）前降支造成心肌IR,对照组则免除结扎松解前降支。应用生理记录仪连续监测两组大鼠缺血开始前及再灌注60 min后心率、平均动脉压等血流动力学指标。全自动生化仪检测缺血前及再灌注60 min后两组大鼠血钙及肌钙蛋白T（cTnT）的水平。荧光定量PCR检测再灌注60 min后两组大鼠左心室缺血区和右心室心肌细胞膜钙转运通道蛋白即心肌细胞膜钠钙交换器1（NCX1），L型钙通道（LVDCC）α-1C和胞膜钙转运ATP酶1（PMCA1 ）mRNA的表达。结果两组大鼠缺血前的心率、平均动脉压均高于再灌注60 min后，而两组间缺血前和再灌注60 min后的心率、平均动脉压差异则无统计学意义。两组血浆Ca2＋浓度在缺血前与再灌注60 min后差异无统计学意义，同时间点两组之间的差异也没有统计学意义。缺血前IR组与对照组血浆cTnT浓度水平相近，缺血60 min后IR组血浆cTnT浓度较对照组升高[（4.29±2.22） μg/L比（1.62±0.60）μg/L，P=0.031]；两组血浆cTnT浓度在缺血前与再灌注60 min后差异也有统计学意义（均P＜0.05）。NCX1，LVDCCα-1C和PMCA1的mRNA表达在再灌注60 min后同心室两组间和同组内左右心室之间的差异均无统计学意义（NCX1：对照组左心室为50±4，右心室为47±9；IR组左心室为55±6,右心室为53±11；LVDCCα-1C：对照组左心室为33±7，右心室为30±7；IR组左心室为28±3，右心室为37±5；PMCA1，对照组左心室为70±10,右心室为53±11；IR组左心室为66±12，右心室为78±8;均P＞0.05）。结论 大鼠在体心肌缺血20 min再灌注60 min后,NCX1、LVDCCα-1C和PMCA1的mRNA表达水平均无显著改变，提示钙超载并非由细胞膜钙转运通道蛋白数量改变引起。

白藜芦醇通过MCU抑制mPTP开放减轻H9c2细胞氧化应激损伤

目的观察白藜芦醇(resveratrol)保护心肌细胞减轻氧化应激损伤的过程是否与线粒体通透性转换孔(mPTP)和线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)相关,并探讨可能的机制。方法H9c2心肌细胞常规培养,随机分为对照组、过氧化氢组、白藜芦醇+过氧化氢组、MCU抑制剂(钌红)+白藜芦醇+过氧化氢组。微板法检测细胞外液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量;Western印迹法检测内质网应激分子伴侣葡萄糖调节蛋白(GRP)78、GRP94和MCU蛋白表达;激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内钙离子(Ca^(2+))、活性氧(ROS)和mPTP变化。结果与对照组相比,过氧化氢显著增加细胞外液中LDH的含量、GRP78、GRP94和MCU蛋白表达、细胞内Ca^(2+)和ROS含量,显著减少mPTP特异性探针TMRE的荧光强度(均P<0.05)。白藜芦醇明显抑制过氧化氢引起的变化,而钌红显著增强白藜芦醇的作用(均P<0.05)。结论白藜芦醇通过MCU减少细胞内Ca^(2+)超载和ROS生成进而抑制mPTP开放,减轻氧化应激引起的内质网应激损伤,保护心肌细胞。

MCU及线粒体分裂介导的曲美他嗪抗心肌缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨线粒体钙单向转运蛋白(MCU)和线粒体分裂在曲美他嗪(TMZ)保护心肌避免缺血再灌注损伤(I/R)中的作用。方法建立小鼠心肌I/R的动物模型,观察TMZ给药对心肌细胞凋亡的作用;建立原代C57BL6乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型(H/R),给与TMZ处理,观察TMZ加入对H/R引起的线粒体MCU表达、线粒体分裂、细胞凋亡相关蛋白表达的作用。通过转染siRNA敲低MCU、腺病毒载体过表达MCU等干预措施,探讨MCU表达对线粒体分裂和细胞凋亡的作用机制。结果在小鼠模型中TMZ可抑制I/R损伤引起的心肌凋亡。体外实验中H/R引起MCU表达上调,增加线粒体分裂和细胞凋亡,而siRNA敲低MCU可逆转这些损伤改变;TMZ下调H/R引起的MCU的高表达并抑制胞浆线粒体分裂蛋白向线粒体转移,从而减少线粒体分裂及细胞凋亡;过表达MCU能取消TMZ对H/R的保护作用。结论TMZ通过下调MCU的表达,减少线粒体分裂,抑制凋亡,从而减轻心肌I/R损伤。