钙离子载体A23187联合卵细胞胞质内单精子注射治疗圆头精子症2例并文献复习

目的:探讨圆头精子症的病因、圆头精子的受精能力,以及人工激活技术在圆头精子症患者卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)治疗中的应用价值。方法:回顾性分析2例圆头精子症ICSI治疗病例,患者配偶的卵子经ICSI处理后,随机分为2组,其中1组卵子接受钙离子载体A23187激活处理,另外1组不接受任何处理。结合国内外文献对圆头精子症的发病原因、受精能力和治疗方案进行复习和讨论。结果:A23187激活处理组均获得优质胚胎,而常规处理对照组的卵子则未受精、未卵裂、无优质胚胎、无囊胚形成。2例患者均移植A23187激活组的优质胚胎,获得妊娠并分娩健康婴儿。结论:A23187可以用于圆头精子症患者的ICSI治疗,并获得较好的临床结局,但还应密切关注A23187的安全性问题。

应用钙离子载体A23187及6-甲基嘌呤对人卵母细胞进行孤雌激活

目的 :观察钙离子载体 A2 3 1 87( Ca-A2 3 1 87)及 6-甲基嘌呤 ( 6-DMAP)对人类卵母细胞的孤雌激活作用。方法 :收集体外受精周期中不适于进行卵胞浆内单精子注射的生发泡期或第一次减数分裂中期的不成熟卵母细胞 2 44个在体外培养成熟 ,其中 1 55个体外成熟卵母细胞按不同激活方案分组 :5μmol/ L Ca-A2 3 1 87组、1 0 μmol/ L Ca-A2 3 1 87组、对照组、6-DMAP组及 Ca-A2 3 1 87+6-DMAP组。激活处理后 1 2～ 1 8h观察第二极体排出及原核形成情况。结果 :5及 1 0 μmol/ L Ca-A2 3 1 87组卵母细胞激活率分别为 40 .7% ( 1 1 / 2 7)和 3 7.1 % ( 1 3 / 3 5) ,较对照组的 9.5% ( 2 / 2 1 )明显增加 ( P<0 .0 1 ) ;6-DMAP组的激活率 ,1 1 .5% ( 3 / 2 6)较 Ca-A2 3 1 87+6-DMAP组 ,58.7% ( 2 7/ 46)明显下降。 Ca-A2 3 1 87激活后卵母细胞主要表现为一原核二极体 ,而 Ca-A2 3 1 87+6-DMAP激活的卵母细胞以一原核一极体占多数 ( 1 9/ 2 7,70 .4% )。结论 :卵母细胞孤雌激活的发生及原核形成类型与激活方案有关 ,单独 Ca-A2 3 1 87或与蛋白激酶抑制剂 6-DMAP联合应用都能使人类卵母细胞发生孤雌激活 。

钙离子载体A23187对人红白血病细胞株K562超微结构的影响

目的观察钙离子载体A23187对人红白血病细胞株K562超微结构的影响，为白血病的治疗提供新思路。方法体外培养K562细胞，密度增至（1-2）×10^5几时随机分为观察组和对照组（容积均为5mL），观察组取2mmol/L细胞溶液加入A23187溶液7．5灿，至最终浓度为3panol/L；对照组加入等体积生理盐水。细胞培养到第10、20和30Jnin时，依次取两组细胞溶液离心、制备超薄切片，H-7500型透射电镜下观察其超微结构。结果对照组K562细胞超微结构无明显改变；观察组K562细胞线粒体呈现空泡样改变和基质深染。结论钙离子载体A23187在体外可能通过改变人红白血病细胞株K562细胞超微结构诱导其凋亡，此为白血病的临床治疗提供了一种新思路。

钙离子载体A23187对转化生长因子β1刺激的肝星状细胞增殖、周期及凋亡蛋白caspase-3表达的影响

目的研究钙离子载体A23187对转化生长因子β_1(TGF-β_1)刺激的肝星状细胞增殖、周期及凋亡蛋白caspase-3表达的影响。方法将液氮保存下的肝星状细胞株,于37℃、50mL/L CO_2孵箱中进行复苏传代培养,同步化后将细胞分为5组:空白组、TGF-β_1(5ng/mL)组、TGF-β_1+低、中、高剂量钙离子载体A23187组,即5ng/mL TGF-β_1刺激24h,再分别加入1、2、4μmol/L不同剂量钙离子载体A23187作用24h后,用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,蛋白免疫印记测定凋亡蛋白caspase-3表达。结果不同浓度钙离子载体A23187均能显著抑制细胞增殖(P<0.05),且随着剂量的增加,细胞的相对增殖率(RGR)降低,低、中、高剂量组分别为85.93%、61.71%、48.43%,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);不同处理组G1期细胞比例、S+G2期细胞比例差异均有统计学意义(P<0.05),钙离子载体A23187剂量越大,G1期细胞比例越高,S+G2期细胞比例越低(P<0.05)。随着钙离子A23187浓度的增加,细胞内caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论钙离子载体A23187可能通过阻滞大鼠肝星状细胞由G1期进入S期和G2期,抑制细胞增殖,同时上调凋亡蛋白caspase-3的表达。

钙离子载体A23187诱导人外周血单个核细胞生成树突状细胞

目的:研究钙离子载体(CI)A23187诱导健康人外周血单个核细胞(PBMNCs)生成树突状细胞(DCs),探索DCs扩增的新方法。方法:分离健康人PBMNCs,分别加入GM-CSF+IL-4,A23187。体外培养72 h后,于光镜、电镜下观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞的表面标志,MTT比色法检测其对同种异体T细胞的刺激增殖作用,ELISA法检测IL-12、IFN-γ的水平。结果:健康人PBMNCs在A23187的条件下培养72 h后,就可以看到典型的DCs形态,CD40、CD86、CD83分子的表达均明显增高,但CD1α分子的表达增高不明显。具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。IL-12、IFN-γ的水平比其他组明显增高。结论:健康人PBMNCs在钙离子载体A23187作用下能更有效地诱导生成成熟DCs。

钙离子载体A23187对喉癌细胞株胞内游离钙浓度及凋亡的影响

目的:观察钙离子载体A23187对喉癌细胞株(Hep2)胞内游离钙[Ca2+]i浓度及凋亡的影响。方法:将Hep2随机分成3个A23187处理组及对照组;以Fura2/AM为荧光指示剂,RF5301PC荧光光度计测定处理后5、24、48h后Hep2[Ca2+]i浓度的变化;用FACS420型流式细胞仪测定细胞凋亡率;DNA琼脂糖凝胶电泳分析不同时间A23187处理Hep2后特征性降解。结果:A23187处理组5、24、48hHep2[Ca2+]i的浓度分别为(123.48±21.54)nmol/L、(110.54±11.32)nmol/L、(88.63±9.95)nmol/L均高于对照组(54.23±8.73)nmol/L,差异有统计学意义(P<0.01)。48h组指标值较5h组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。A23187处理5、24、48h细胞凋亡率分别为(3.84±1.12)、(7.65±1.35)、(9.49±1.31),均高于对照组(2.63±0.75),差异有统计学意义(P<0.01),且有时间反应关系(r=0.923、0.748)。DNA电泳呈典型的“梯状”条带。结论:A23187可影响Hep2[Ca2+]i浓度,Hep2[Ca2+]i与其凋亡率密切相关。

红细胞在钙离子和离子载体A23187作用下的流变特性研究

用新激光衍射法研究了钙离子及离子载体A2 3187对红细胞流变特性的影响 .用不同浓度的钙离子及离子载体A2 3187分别处理红细胞后 ,测量其取向指数和小变形指数 .结果表明离子载体A2 3187较细胞外钙离子浓度对红细胞流变特性的影响更大 .而且 ,最大取向指数和最大小变形指数随着钙离子及离子载体A2 3187浓度的增加而降低 .离子载体A2

钙离子载体和Poly(I:C)诱导人外周血来源的树突状细胞成熟的研究

目的:探讨从健康人外周血中体外诱导培养出成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法。方法:用密度梯度离心法分离人外周单个核细胞(PBMC),再用贴壁法获取单核细胞后加入GM-CSF和IL-4,培养5天后分5组:第1组为对照组,仅含有上述细胞因子;第2组,加入多聚次黄嘌呤胞嘧啶核苷酸[Poly(I:C)];第3组,加入钙离子载体(A23187);第4组,加入Poly(I:C)和CI;第5组,加入TNF-α。显微镜下观察培养细胞形态,流式细胞术检测DC表型,体外同种混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激T细胞的增殖活性。结果:第四组细胞具有典型的树突状细胞的特征,且高表达CD83、CD80、CD86和CD40分子,具有更强的刺激T细胞增殖能力。结论:经过组合细胞因子诱导能够培养出PBMC来源的DC,且经CI和Poly(I:C)进一步诱导后获得更成熟和功能更强DC。

钙离子载体对外周血单核细胞来源的树突状细胞的影响

目的:探讨钙离子载体(calcium ionophore,CI)对外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的影响。方法:分离健康献血者外周血单核细胞,分别加入重组人粒/单集落刺激因子(rhGM-CSF)100μg/L、rhGM-CSF 100μg/L+CI 10μg/L及rhGM-CSF+CI各100μg/L。体外培养40 h后,于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志,MTT比色法检测上述分子对自体T细胞的刺激增殖作用。结果:外周血单核细胞在GM-CSF+CI各100μg/L的条件下培养40 h,就可看到典型的DC形态,其表面CD14分子表达减少,HLA- DR、CD40、CD83及CD86分子的表达明显增高,且具有明显 刺激自体T细胞增殖的能力。结论:CI有显著加速GM-CSF 诱导的外周血单核细胞向DC转化的作用。

钙离子载体上调K562细胞B7分子表达

目的:探讨钙离子载体(Calc ium ionorphore,C I)对慢性髓系白血病细胞株K562细胞表面B7分子表达的上调作用。方法:将生长状态良好的K562细胞在含C I(375 ng/m l)的培养基中培养,以不含C I培养的K562细胞作对照组。培养0、48和96小时后台盼蓝拒染法检测细胞数和细胞存活率,流式细胞仪检测培养前及培养96小时后细胞表面B7分子的表达情况,MTT比色法检测其刺激同种异体T细胞增殖的作用。结果:K562细胞表面B7分子缺如或低表达;用含C I的培养基培养96小时后,可显著上调B7分子的表达,且能明显激活同种异体T细胞。培养前后细胞形态无明显变化,加C I培养的K562细胞较不加C I培养的细胞生长缓慢。结论:慢性髓系白血病细胞株K562细胞表面存在B7分子表达缺陷,C I可上调其B7分子。C I可能有抑制K562细胞生长的作用。

钙离子载体及咖啡因对绵羊精子获能的影响

通过添加不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10μmol/L）的钙离子载体（A23187,IA）及2 mmol/L咖啡因,探讨不同作用时间其对绵羊精子体外获能的影响。结果发现,IA浓度越高,精子的体外获能率越高,顶体反应率越低,活力越低,死精子就越多;而延长作用时间对获能、顶体反应的影响不明显。IA和咖啡因共同作用后,咖啡因能够促进IA诱导顶体反应的发生。建议用IA诱导绵羊精子获能时,其浓度以0.050.2μmol/L为宜,作用时间1 min。

钙离子载体诱导人外周血单个核细胞向树突状细胞分化的信号转导

目的 :初步探讨钙离子载体 (calciumionophore,CI)诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)向树突状细胞 (DC)分化的细胞信号转导途径。方法 :分离健康献血者的PBMC ,加入rhGM CSF及A2 3187各 10 0 μg/L ,部分细胞预先用W 7(10 μmol/L)或CsA(0 .5mg/L)或KT5 92 6 (1μmol/L)处理 30min后 ,再加入rhGM CSF及A2 3187各 10 0 μg/L。体外培养 4 0h后 ,于相差显微镜下观察细胞的形态 ;流式细胞仪检测细胞的表面标志 ;用MTT比色法检测上述细胞刺激同种异体T细胞的增殖作用。结果 :与 10 0 μg/L的A2 3187及rhGM CSF共同培养 4 0h的健康献血者的PBMC ,出现典型的树突状突起 ,同时CD83、CD80及CD86分子的表达上调 ,CD14分子的表达下调 ,刺激同种异体T细胞增殖的能力增强 ;而预先用W 7或CsA或KT5 92 6处理 30min后、再给予rhGM CSF及A2 3187处理的PBMC ,其形态、表面标志物及对T细胞的刺激增殖能力 ,均不同程度的受到抑制。结论 :CI诱导的PBMC向DC的分化 ,可能受控于Ca2 +

肝素和钙离子载体诱导猪射出精子体外获能的研究

本文采用肝素和钙离子载体诱导猪射出精子体外获能,根据对去透明带仓鼠卵的穿透情况评价获能效果,并用台盼兰·姬姆萨染色观察精子的死活及顶体状态。结果表明,未经获能处理的猪精子不能穿透仓鼠卵,肝素和I-A均能诱导猪精子体外获能并引起顶体反应。经获能处理的精子,在授精后2小时穿透卵子,4小时开始形成雄原核,6小时形成发育良好的雄原核。肝素处理以100μg效果最好,穿透率达77.8%,有原核卵百分率达47.2%;I-A处理以0.3uM为宜,穿透率达66.7%,有原核卵百分率达42.4%。咖啡因与肝素和I-A具有协同作用,能提高精子的穿透能力。有顶体反应的活精子百分率与穿透率呈强正相关(肝素组:r=0.97,P<0.01;I-A组:r=0.94,P<0.01)。

钙离子载体ionomycin引起内耳毛细胞胞内游离钙变化的研究

为研究听毛细胞的钙信号转导 ,观察了钙离子载体 ionomycin引起毛细胞胞内游离钙变化的过程。分离的豚鼠耳蜗外毛细胞经钙敏荧光染料 fluo-3和 fura-red染色后 ,用激光扫描共聚焦显微镜进行检测 ,以 fluo-3 /fura-red荧光比值指示胞内游离钙浓度高低。 5～ 10μmol/L ionomycin作用后 ,外毛细胞胞内游离钙由静态比值 1.69± 0 .5 9增至峰值时的 2 .78± 1.43 (x± s,n=10 ,P<0 .0 5 )。外毛细胞胞内游离钙增高的时程有两种模式 ,一种为胞内游离钙在药物作用后 10～ 3 5 s即有明显增加 (n=6) ,部分呈双相升高 ;另一种在药物作用后经过约 2 0 0～ 3 0 0 s的潜伏期 ,胞内游离钙方出现明显增加 (n=4)。一个外毛细胞在ionomycin作用后有钙波形成。ionomycin作用后外毛细胞胞内游离钙动态变化的多种模式显示了其作用机制和内耳毛细胞钙调控过程的复杂性 。

肝素和钙离子载体诱导波尔山羊精子体外获能和体外受精

运用肝素、钙离子载体(IA)协同咖啡因诱导波尔山羊精子体外获能,利用去透明带金黄地鼠卵穿透试验检测了精子的获能效果。结果发现:精卵孵育4h和6h时的穿透率均高于2h时的穿透率;肝素和钙离子载体对精子获能有明显的促进作用,与未添加组相比差异极显著(P<0.01);20mg/L和50mg/L的肝素剂量组,去透明带金黄地鼠卵穿透率为64.7%、68.4%;钙离子载体的添加剂量在0.3μmol/L时,穿透率达到68.2%;咖啡因与肝素、钙离子载体具有明显的协同作用。将获能的精子与山羊卵母细胞进行体外受精孵育17h,也获得了60%以上的受精率。

钙离子载体体外诱导外周血造血干细胞定向分化为成熟树突状细胞的研究

目的 以实体瘤患者外周血造血干细胞为来源 ,探讨体外诱导更成熟、功能更强的树突状细胞 (DC)的方法。方法 以血细胞分离机分离经动员的外周血造血干细胞 (PBSC) ,加入rhGM CSF、rhIL 4和rhTNF α培养 9d后分两组 ,其中一组洗去含细胞因子的培养液 ,并给予钙离子载体 (CI)A2 3187处理 2 4h ,而另一组仍维持原培养液培养 2 4h ;对所获得的两组细胞分别进行细胞形态学、细胞表面抗原及刺激同种异体混合淋巴细胞反应 (allo MLR)能力的分析。结果 两组细胞在倒置显微镜和扫描电镜下均显示典型的树突状细胞形态 ,流式细胞仪分析均高表达CD1α、HLA DR、CD80和CD4 0分子 ;但给予A2 3187进一步处理 2 4h的细胞比无A2 3187处理的细胞表达更丰富的CD86和CD83分子及具有更强的刺激allo MLR的能力。结论 组合细胞因子培养获得的PBSC来源的DC ,经CI进一步诱导后可获得更成熟及功能更强的DC。

组合性细胞因子与钙离子载体诱导急性髓系白血病细胞向树突状细胞分化中的作用

目的:探讨钙离子载体能否诱导急性髓系白血病细胞分化为树突状细胞及其抗肿瘤免疫。方法:选择2004-01/09解放军广州军区广州总医院血液科住院的初诊或复发的急性髓系白血病患者7例。分离急性髓系白血病患者的急性髓系白血病细胞,在体外给予钙离子载体100μg/L培养3～5d(钙离子载体组),或1000U/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、1000U/mL白细胞介素4和500U/mL肿瘤坏死因子α培养7～10d(组合细胞因子组)。通过细胞形态的观察及细胞免疫表型的检测鉴定树突状细胞,用同种异体混合淋巴细胞实验及细胞毒实验检测树突状细胞的功能。结果:①形态学观察和免疫表型变化:钙离子载体组及组合细胞因子组诱导急性髓系白血病细胞均可获得具有典型树突状细胞形态及免疫表型的成熟树突状细胞,但钙离子载体组诱导的树突状细胞表面CD80,CD86,CD83,CD40,CD54等分子的表达较组合细胞因子组明显增高。②混合淋巴细胞反应和胞毒性T淋巴细胞活性:钙离子载体组所诱导的急性髓系白血病细胞刺激同种异体混合淋巴细胞反应的能力及激发细胞毒性T淋巴细胞的活力比组合细胞因子组强。结论:钙离子载体能高效诱导急性髓系白血病细胞分化成树突状细胞,比组合细胞因子诱导分化的树突状细胞功能更强。

钙离子载体对猪去透明带卵孤雌发育的影响

比较了不同浓度 ( 0 .62 5～ 1 0 .0μmol/L )的钙离子载体 ( A2 31 87)结合 DMAP( 2 mmol/L )处理对经体外成熟培养后去除透明带的猪卵母细胞孤雌激活效果。孤雌激活卵采用微穴法 ( WOWs)体外培养至第 7d。试验结果表明 ,使用 2 .5μmol/L的 A2 31 87激活猪去透明带卵效果最好 ,其第 7d的发育囊胚率 ( 2 4.6%)显著高于 0 .62 5～ 1 .2 5μmol/L组 ( 8.1 %～ 1 2 .8%,P<0 .0 5)。当 A2 31 87激活浓度增加到 1 0 .0 μmol/L 时 ,去透明带卵激活处理后的死亡率 ( 2 9.5%)明显高于其它各组 ( 0 %～4.9%)。采用钙离子载体 A2 31 87激活体外成熟猪去透明带卵 ,其最佳推荐浓度为 2 .5μmol/L。

钙离子载体诱发马鹿精子顶体反应效果

以马鹿（ Cervus elaphus）为试验动物，采用上浮法诱导马鹿精子体外获能，以钙离子载体（ A23187）诱导马鹿精子顶体反应，进而摸索钙离子载体（ A23187）诱发其顶体反应的适宜体系。结果表明：0．01～100．00μmol/L的A23187可提高获能马鹿精子的顶体反应率；其中适宜的A23187浓度为0．10μmol/L，反应的时间为5 min，顶体反应率为（74．00±2．62）％。 A23187能促进获能马鹿精子的顶体反应，但不能显著（P＞0．05）促进未获能马鹿精子的顶体反应。

钙离子载体诱导HL-60细胞分化成树突状细胞的实验研究

目的 :探讨一种钙离子载体 (calciumionophore,CI)A2 3187,能否诱导早幼粒白血病细胞株HL 6 0分化成具有活性的树突状细胞 (dendriticcells,DCs)。方法 :将生长状态良好的HL 6 0细胞分别加在普通培养液中 ,或在含不同浓度 (2 5～ 16 0 0 μg/L)的A2 3187及 10 0 μg/L重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF)的普通培养液中培养。 2 4～ 96h后 ,在光镜及电镜下观察细胞的形态 ;用流式细胞仪检测细胞的表面标志 ,MTT比色法检测其刺激同种异体T细胞增殖的作用。结果 :HL 6 0细胞以适量 (2 0 0 μg/L)的A2 3187诱导 2 4h ,DC的特征性表面标志CD83分子的表达最高 ,72h可出现典型的树突状突起 ,96h细胞表面CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2 )、MHC II分子及细胞间黏附分子CD5 4的表达最高 ,且能明显激活同种异体T细胞。结论 :钙离子载体A2 3187可将HL 6 0细胞诱导成具有活性的DC样细胞。