L型钙离子通道CaV1.2蛋白在大鼠七氟烷麻醉中的作用

目的探讨CaV1.2蛋白在七氟烷麻醉机制中的作用。方法 40只成年雄性SD大鼠,体重(200±20)g,随机分为5组(n=8):对照组(control)、七氟烷1h组(sevo1h)、七氟烷2h组(sevo2h)、七氟烷3h组(sevo3h)和七氟烷4组(sevo4h),大鼠七氟烷麻醉状态以翻正反射消失为监测指标,麻醉深度维持在1.5 MAC,麻醉时间分别为1h、2h、3h、4h。麻醉结束后行大脑皮层HE染色观察神经细胞形态学,Western blot、免疫组化检测CaV1.2蛋白改变。结果各组大鼠给予1.5 MAC的七氟烷麻醉,麻醉诱导时间(翻正反射消失的时间)、呼吸、心率和血压及动脉血pH值、PCO_2、PO_2和HCO_3^-差异均无统计学意义(P均>0.05)。HE染色结果显示大脑皮层神经细胞无形态学改变,说明1.5MAC七氟烷麻醉1~4h没有造成神经细胞损伤。与control组相比,随着七氟烷麻醉时间的延长,大鼠大脑皮层区CaV1.2阳性细胞表达率和CaV1.2蛋白表达量逐渐降低(P<0.05);麻醉sevo4h组CaV1.2阳性细胞表达率低于control和sevo1h组(P均<0.05);sevo3h与sevo4h组大鼠大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达量均低于control组(P均<0.05),且sevo3h组高于sevo4h组(P<0.05)。结论 L型钙离子通道CaV1.2蛋白表达下调参与了七氟烷的麻醉作用。

Snapin蛋白与心肌L型钙离子通道Cav1.3的相互作用

[目的]研究Snapin蛋白与心肌L型钙离子通道Cav1.3的相互作用。[方法]利用免疫共沉淀实验确定Snapin蛋白与Cav1.3在体外表达系统和心房组织存在相互作用。[结果]在过表达Snapin和Cav1.3的HEK293细胞及内源性表达二者的心房肌组织中,Snapin蛋白与Cav1.3钙离子通道存在相互作用。

苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究

目的:探讨抗癫痫药物苯妥英(PHT)对心肌细胞(CMs)中L型钙通道(Cav1.2)蛋白合成和转运的影响。方法:对无特定病原体(SPF)级雄性Sprague-Dawley(SD)乳鼠的原代CMs分别使用不同浓度的PHT(0μg/mL、0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)干预24 h和48 h,采用CellTiter-Glo法检测细胞活性。采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)和激光扫描共聚焦显微镜分别观察PHT对原代CMs中Cav1.2通道蛋白合成和转运的影响。结果:在CellTiter-Glo细胞活性检测中,随着苯妥英浓度的增加,除100μg/mL组干预48 h后细胞存活率降低至85.23%(P<0.05)外,其余各组间细胞活性比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Western Blot结果显示,100μg/mL苯妥英干预原代CMs时Cav1.2合成明显受到抑制,然而激光扫描共聚焦显微镜结果提示在10μg/mL苯妥英干预原代CMs时已出现Cav1.2转运障碍。结论:苯妥英可抑制心脏Cav1.2的合成和转运,可能与其可致心律失常作用相关,临床上在应用苯妥英时应仔细评估病人情况,尽可能减少副作用的产生。

低强度脉冲超声对大鼠牙本质损伤修复过程中钙离子转运相关蛋白表达的影响

目的:研究低强度脉冲超声(LIPUS)辐照SD大鼠牙本质损伤模型后对成牙本质细胞及牙髓细胞上钙离子转运相关蛋白的影响。方法:40只SD大鼠[(360±13)g]右侧上颌第一磨牙备洞建立牙本质损伤模型,随机对其中20只大鼠备洞牙及剩余20只大鼠左侧上颌第一磨牙予以超声辐照(强度30 mw/cm^2,频率1.5 MHz,频宽200μm,重复率1 kHz),形成备洞组、备洞+LIPUS组、LIPUS组及空白对照组(n=10),超声辐照每日1次,持续20 min,分别在辐照1、3、7、14 d后处死实验动物,应用HE染色观察牙本质-牙髓复合体组织结构及细胞形态变化,免疫组化染色及图像分析检测钙离子转运相关蛋白(Cav 1.2、NCX1)的表达差异。结果:组织形态学分析发现牙本质损伤后LIPUS可协同炎症反应促进第三期牙本质的形成,而LIPUS辐照正常牙未见明显病理改变出现。免疫组化分析发现备洞+LIPUS组在1 d及3 d时较备洞组各蛋白表达明显升高(P<0.05);LIPUS组1 d时Cav1.2表达较空白对照组高(P<0.05),其余时间点两者无差异。结论:LIPUS可能在牙本质损伤早期积极调控钙离子转运相关蛋白,加快第三期牙本质修复进程,其作用机制可能与炎症反应及机械效应相关。

蓝光对人视网膜色素上皮细胞内钙离子浓度的影响及机制研究

目的:观察蓝光对人视网膜色素上皮细胞内钙离子浓度的影响并初步探讨其可能机制。方法:利用35 W白色冷光灯加用蓝色滤光片建立蓝光损伤体外培养的RPE细胞模型,蓝光控制波长范围在470~520nm,光照强度在2000lux左右,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测RPE细胞内游离钙离子浓度,利用Western blot技术和膜片钳技术分别检测RPE细胞Cav1.2蛋白的表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能。结果:与对照组相比,照射组的RPE细胞内游离钙离子浓度增加;照射后RPE细胞Cav1.2蛋白表达增加,且L型电压依赖性钙离子通道功能增强。结论:蓝光可通过增加RPE细胞Cav1.2蛋白表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能促进细胞内游离钙离子浓度的增加,从而引起RPE细胞的损伤,L型电压依赖性钙离子通道有望成为治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病的新靶点。

Genistein通过影响Ca^(2+)/CaM/Cav1.2/CaMKⅡ信号通路抑制Aβ_(25-35)诱导的海马神经元损伤

目的探讨植物雌激素染料木素(Genistein,GST)对Aβ25-35引起海马神经元钙超载损伤的抑制作用及其机制。方法本实验分为以下4组:正常对照组,Aβ25-35组,Aβ25-35+Genistein组(Aβ25-35+GST组),Aβ25-35+17β-雌二醇组(Aβ25-35+E2组),通过MTT比色法测定细胞活性,选取Genistein的最适浓度。采用Aβ25-35处理建立海马神经元损伤模型。利用Tuj1染色观察神经元生长状态,激光共聚焦扫描观察Genistein对[Ca2+]i的影响,通过Western blot技术检测Ca M、Cav1.2、p-Ca MKⅡ/Ca MKⅡ蛋白表达的变化。结果 0.3μg/ml Genistein能明显抑制Aβ25-35引起细胞活性降低及[Ca2+]i增加,并能对抗Aβ25-35引起的Ca M,Cav1.2蛋白水平增加及p-Ca MKⅡ减少。结论 Genistein具有拮抗Aβ25-35所致海马神经元钙超载损伤的作用,其作用机制可能与Ca2+/Ca M/Cav1.2/Ca MKⅡ信号通路有关,为Genistein进一步应用于临床治疗神经退变性疾病提供理论依据。

白果内酯对糖氧剥夺小鼠原代海马神经元内钙离子浓度的影响

目的:观察白果内酯对糖氧剥夺(OGD)后小鼠原代海马神经元内游离钙离子浓度的影响及机制探究。方法:分离和培养小鼠原代海马神经元,实验分为对照组(control)、糖氧剥夺组(OGD)和白果内酯组(OGD+bilobalide),对照组予以常规培养小鼠原代海马神经元,糖氧剥夺组利用氧葡萄糖剥夺/再恢复模型模拟小鼠原代海马神经元的缺血再灌注损伤,白果内酯组在氧葡萄糖剥夺后再恢复前应用20μmol/L的白果内酯。利用流式细胞仪检测各组小鼠原代海马神经元内游离的钙离子浓度,利用Western Blot技术检测各组小鼠原代海马神经元Cav1.2蛋白的表达,最后利用膜片钳技术检测各组小鼠原代海马神经元L型电压依赖型钙离子通道的功能。结果:与糖氧剥夺组相比,白果内酯组小鼠原代海马神经元游离钙离子浓度降低(P<0.05)、Cav1.2蛋白表达量减少(P<0.05)、L型电压依赖性钙离子通道功能减弱(P<0.05),但仍未恢复到对照组水平(P<0.05)。结论:白果内酯可能通过减少小鼠原代海马神经元Cav1.2表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能降低细胞内游离钙离子浓度,从而发挥对糖氧剥夺后神经元的保护作用。

人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞内钙离子浓度的影响

目的观察人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞内钙离子浓度的影响。方法实验分为对照组和人参皂甙Rh2组,对照组应用常规培养基培养人胶质瘤细胞株U87MG,人参皂甙Rh2组在常规培养基中人参皂甙Rh2的浓度为20μg/m L,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测各组培养的人胶质瘤细胞内钙离子浓度,再利用Western blot技术检测人胶质瘤细胞Cav1.2蛋白的表达,最后利用膜片钳技术检测人胶质瘤细胞L型电压依赖型钙离子通道的功能。结果人参皂甙Rh2处理U87MG细胞后,细胞内钙离子浓度是对照组的2.5倍(P<0. 05);人参皂甙Rh2培养后胶质瘤细胞Cav1.2蛋白表达量是对照组的1.5倍(P<0. 05),且L型电压依赖性钙离子通道功能增强。结论人参皂甙Rh2可通过增加胶质瘤细胞Cav1.2表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能促进细胞内游离钙离子浓度的增加,从而诱导人胶质瘤细胞的凋亡。

山奈酚对缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探究山奈酚对缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响和机制。方法:利用随机数字法将H9C2大鼠心肌细胞随机分为三组,对照组细胞在常规孵箱培养,缺氧/复氧组细胞利用缺氧孵箱和常规孵箱交替培养,山奈酚组细胞在缺氧/复氧培养的基础上应用30μmol/L山奈酚。分别利用流式细胞仪和多核苷酸链断裂技术检测各组细胞凋亡水平,利用蛋白印迹技术检测凋亡相关蛋白和钙离子通道蛋白含量,利用免疫荧光技术检测细胞中钙离子浓度。结果:和对照组比较,缺氧/复氧组细胞凋亡增加,钙离子通道蛋白Cav1.2表达和细胞中钙离子含量增加(均P<0.05);和缺氧/复氧组比较,山奈酚组细胞凋亡减少,钙离子通道蛋白Cav1.2表达和胞内钙离子浓度减少(均P<0.05)。结论:山奈酚可能通过减少钙离子通道蛋白Cav1.2表达和胞内钙离子浓度抑制缺氧/复氧损伤诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡。

CSL与CaV 1.2钙通道N末端的相互结合作用

目的探讨钙蛋白酶抑素结构域L(CSL)与CaV1.2钙通道N末端(NT)之间的相互结合作用。方法利用I-TASSER同源建模服务器,对豚鼠CaV 1.2钙通道N末端和人源CSL蛋白进行同源建模,利用MOE软件预测CSL和NT蛋白之间的结合,并采用GST pull-down实验研究CSL和NT蛋白的结合特点。结果与MOE软件预测出CSL和NT蛋白可以结合,且在NT蛋白上存在两个结合位点;Pull-down实验进一步证实二者可以直接结合,且该结合具有CSL浓度依赖性。结论 CSL可以与NT蛋白结合,为进一步揭示CaV1.2钙通道的调节机制奠定了基础。