钙蛋白酶2通过诱导三阴乳腺癌细胞上皮间质转化抵抗紫杉醇的机制探讨

目的观察钙蛋白酶2(Calpain-2)在三阴乳腺癌细胞抵抗紫杉醇(PTX)中的作用及机制。方法人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞转染Calpain-2质粒及相应空载体,设为过表达组和空载体组,同时以未转染细胞作为空白组。MTT法检测PTX对各组细胞存活率的影响;免疫荧光实验检测YAP的分布情况;蛋白质免疫印迹实验检测Calpain-2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、磷酸化大肿瘤抑制基因1(pLATS1)及磷酸化yes相关蛋白(p-YAP)表达。在过表达Calpain-2的基础上加用YAP抑制剂XMU-MP-1进行干预,观察YAP对PTX抵抗的介导作用。结果与空载体组相比,PTX处理后过表达组细胞存活率增加,半数抑制浓度(IC50)升高(P<0.05)。与空载体组相比,过表达组细胞N-cadherin和Vimentin蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05),p-LATS1和p-YAP蛋白表达上调(P<0.01),YAP在细胞核内分布减少。与过表达组相比,XMU-MP-1+过表达组N-cadherin和Vimentin蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调(P<0.01)。PTX处理后,与过表达组相比,XMU-MP-1+过表达组细胞存活率减少,IC50降低(P<0.01)。结论Calpain-2通过YAP诱导三阴乳腺癌细胞上皮间质转化,从而对PTX产生药物抵抗。

钙蛋白酶2及自噬相关蛋白5对内质网应激诱导的肝细胞凋亡的影响

目的:探讨二硫苏糖醇(DTT)诱导大鼠正常肝细胞BRL-3A发生内质网应激(ERS)过程中钙蛋白酶2(calpain-2)及自噬相关蛋白5(Atg5)对肝细胞凋亡的影响。方法:采用2.0 mmol/L DTT处理BRL-3A细胞0、6、12和24 h,诱导细胞发生ERS;实时无标记细胞分析仪(RTCA)检测DTT对BRL-3A细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;real-time PCR检测calpain-2和Atg5的m RNA表达;Western blot检测calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12和微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白水平的变化;免疫共沉淀(Co-IP)方法研究calpain-2与Atg5之间的相互作用。结果:不同浓度的DTT处理细胞后,细胞增殖受到显著抑制;流式细胞术检测凋亡发现,DTT处理BRL-3A细胞6、12和24 h后,细胞凋亡较0 h组显著增多(P<0.05)。流式细胞术检测细胞周期发现,DTT处理细胞后,细胞被阻滞在G1期(P<0.05)。DTT处理细胞6、12和24 h后,细胞中calpain-2和Atg5的m RNA表达水平较0 h组显著上调(P<0.05),calpain-2、Atg12和Atg7的蛋白水平也较0 h组显著升高,且LC3-II/LC3-I比值明显增大,而Atg5的表达较0 h组显著降低(P<0.05)。Co-IP发现,calpain-2抗体可以将Atg5蛋白从细胞裂解物中沉淀下来,Atg5抗体也可以将calpain-2从细胞裂解物中沉淀下来,证实calpain-2与Atg5之间存在相互作用。结论:calpain-2可能通过与Atg5之间的相互作用参与ERS诱导的肝细胞凋亡过程。

葛根素对顺铂致毒小鼠耳蜗钙蛋白酶2表达的影响

目的研究葛根素对顺铂致毒小鼠耳蜗钙蛋白酶2(Calpain 2)表达的影响。方法健康BALB/c小鼠60只,随机分成对照组(腹腔注射等量生理盐水)、顺铂组(腹腔注射顺铂4.5mg·kg^(-1)·d^(-1))、顺铂+葛根素组(一侧腹腔注射顺铂4.5mg·kg^(-1)·d^(-1),对侧腹腔注射葛根素200mg·kg^(-1)·d^(-1))和葛根素组(腹腔注射葛根素200mg·kg^(-1)·d^(-1)),每组15只。各组小鼠给药前后进行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试,于停药并完成ABR测试后取动物听泡显微镜下观察耳蜗外毛细胞缺失情况,应用免疫荧光染色和蛋白质印迹技术检测各组耳蜗Calpain 2的表达。结果顺铂组小鼠ABR阈移和外毛细胞缺失率较对照组明显增大(P<0.01),耳蜗内Calpain 2表达较对照组明显增强(P<0.01);顺铂+葛根素组小鼠ABR阈移和外毛细胞缺失率(底回、中回)较顺铂组明显减少(P<0.01),耳蜗Calpain 2表达较顺铂组明显减弱(P<0.01);而葛根素组ABR阈移、外毛细胞缺失率及Calpain 2表达与对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论葛根素可有效抑制顺铂所致小鼠耳蜗Calpain 2的高表达,以减轻顺铂的耳毒性,改善小鼠听功能。

钙蛋白酶2介导雌激素调控乳腺肿瘤细胞GREB1基因表达

目的:探讨钙蛋白酶2(CANP2)对17β-雌二醇(E2)刺激MCF-10A转化细胞增殖能力、GREB1基因表达的影响及其机制。方法:以乳腺癌MCF-10A转化细胞为研究模型,乳腺癌MCF-7细胞为阳性对照,采用E2(50 nmol/L)刺激2种细胞24 h后,平板克隆方法观察细胞的增殖能力;以0.1%的二甲亚砜(DMSO)刺激MCF-10A、MCF-7细胞作为阴性对照组,以CANP抑制剂Calpeptin(Calp)预处理2刺激的MCF-10A转化细胞1 h或shRNA-CANP2转染2刺激的MCF-10A转化细胞沉默基因表达,同时设立E2对照组和转染空载体E2对照组,采用qRT-PCR检测细胞中GREB1基因表达水平,平板克隆方法观察细胞的增殖能力。结果:与阴性对照比较,E2能上调MCF-10A转化细胞和MCF-7细胞中GREB1基因表达(P<0.01,P<0.05);与E2对照组比较,Calpeptin能抑制E2上调MCF-10A转化细胞和MCF-7细胞的GREB1基因表达,并促进细胞的增殖(P<0.01);与转染空载体E2对照组相比,shRNA-CANP2基因沉默能使MCF-10A转化细胞和MCF-7细胞增殖能力减弱(P<0.01),并抑制E2刺激的MCF-10A转化细胞中GREB1表达的上调(P<0.01,P<0.05)。结论:可能通过CANP2 E2诱导恶性转化乳腺上皮细胞GREB1基因的表达和细胞生长。

钙中性蛋白酶2及Bax在肝纤维化大鼠肝组织中的表达变化及意义

目的:探讨钙中性蛋白酶2(calpain 2)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)在肝纤维化过程中的表达变化及其在肝纤维化过程中的可能作用。方法:雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照4周、8周组和肝纤维化模型4周、8周组,每组各10只。肝纤维化组按3 mL/kg体重的剂量皮下注射40%CCl4植物油溶液,每隔3 d注射1次,造模时间分别为4周和8周;对照组大鼠皮下注射等量植物油溶液。采用TUNEL法检测肝组织中肝细胞凋亡情况;real-time PCR检测肝组织中calpain 2及bax mRNA的表达变化。免疫组织化学法及Western blotting检测肝组织中calpain 2及Bax蛋白的表达情况。结果:Real-time PCR检测发现肝纤维化4周和8周组大鼠肝组织中calpain2及bax mRNA表达较相应的正常对照组显著增加。免疫组化及Western blotting检测显示肝纤维化4周组大鼠肝组织中calpain 2蛋白的表达与正常4周组比较无显著差异;随着肝纤维化程度的加重,肝纤维化8周时大鼠肝组织中calpain 2的表达显著增加;而肝组织中Bax的表达从肝纤维化4周时就显著增加,肝纤维化8周时达到高峰。此外,通过TUNEL法检测发现肝纤维化4周和8周组大鼠肝组织中肝细胞凋亡的数目较正常组大鼠显著增加。结论:Calpain 2与Bax可能参与了肝纤维化的发生发展过程。

钙激活中性蛋白酶-2对整合素β4水解的影响

目的:观察乳腺癌细胞系MCF7细胞中,钙激活中性蛋白酶2(calpain-2)对整合素(integrin)β4水解的影响。方法:利用"短发夹"RNA(shRNA)和微小RNA(mirRNA)技术结合的calpain-2基因沉默(gene silencing)慢病毒质粒(GIPZ lentiviral shRNAmir)转染乳腺癌细胞株MCF7,嘌呤霉素筛选稳定沉默calpain-2基因的细胞株,细胞株传4代,用荧光显微镜观察转染效率,用蛋白质印迹(Western blot)实验检测calpain-2基因沉默效率及integrinβ4水解的情况。结果:嘌呤霉素筛选、细胞传4代,荧光显微镜下观察显示转染和筛选后,EGFP表达阳性的MCF7细胞的比例分别达到(95.6±2.6)%(空shRNAmir载体)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2),差异无统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示,基因沉默的MCF7细胞中calpain-2的表达被明显抑制,相对于空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,差异有统计学意义(P<0.01),calpain-2的表达下调到21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2),空shRNAmir载体转染的MCF7细胞中calpain-2的表达与未转染的MCF7细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05);比较calpain-2基因沉默和空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,发现integrinβ4均被水解,水解片段的分子量主要有200 k D、130和95 k D;calpain-2基因沉默后,calpain-2基因沉默MCF7细胞中200 k D的水解片段比空shRNAmir载体转染的MCF7细胞减少(P<0.01)。结论:在乳腺癌细胞MCF7中,calpain-2可能参与integrinβ4的200 k D片段的形成,从而参与调整integrinβ4的构象变化。

钙激活中性蛋白酶-2对肝癌细胞阿霉素耐药性的影响

目的观察阿霉素作用下,钙激活中性蛋白酶-2(cal-pain-2)在肝癌细胞(HepG2)中的表达及其对细胞存活率的影响,评价其作为抗癌药靶的可能性。方法以倍比稀释的ADM作用于HepG2细胞,用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)实验检测阿霉素(Adriamycin,ADM)72 h的半数致死量(LD50);用蛋白质印迹(Western blot)检测的ADM(LD50)作用下,calpain-2和cyclin E的表达和酶解情况;给予calpain-2抑制剂(calpastatin peptide)干预后,用MTT法观察ADM对HepG2细胞存活率的影响。结果 MTT实验结果显示,ADM对HepG2的LD50为2.5μmol.L-1;Western blot发现,随ADM作用时间的延长,calpain-2的表达水平增高(P<0.01),而且被剪切的程度增加(P<0.05);MTT检测ADM对HepG2的作用发现,calpastatin peptide干预的细胞存活率明显低于对照组(P<0.01),Cyclin E被剪切的程度减轻(P<0.01)。结论肝癌细胞HepG2在ADM作用下发生凋亡的同时,也上调calpain-2的表达水平和活性,并通过其信号通路降低对ADM的敏感性,而针对calpain-2的活性抑制可以提高HepG2对ADM敏感性,提示calpain-2可以作为降低肿瘤化疗耐药性的潜在靶点。

钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达与老年瓣膜病患者心房颤动发生的关系

目的探讨钙蛋白酶-2和钙调神经磷酸酶蛋白表达与老年瓣膜病患者心房颤动发生的关系。方法选取因瓣膜病接受瓣膜置换术的老年患者46例,收集术前临床资料,根据心律情况分为窦性心律组(20例)、房颤组(26例)。以外科换瓣手术取下的右心耳肌组织为研究标本,蛋白印迹法检测钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达水平。结果房颤组患者心率、服用地高辛比例均明显高于窦性心律组(P<0.05);超声心动图检查结果显示,房颤组患者左心房内径厚度明显大于窦性心律组(P<0.05)。房颤组患者心肌组织中钙蛋白酶-2表达水平明显高于窦性心律组(P<0.05),钙调神经磷酸酶脂蛋白催化亚基的全长分子(分子质量60 000)和不含自抑区的活性分子片段(分子质量45 000)表达水平明显高于窦性心律组(P<0.05)。结论钙蛋白酶-2-钙调神经磷酸酶信号通路参与老年瓣膜性房颤的发生。

钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达与瓣膜性房颤发生的关系

目的探究钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)蛋白表达与心脏瓣膜病病人发生心房颤动的关系。方法入选因心脏瓣膜病住院接受瓣膜置换手术的病人48例,搜集术前心电图、超声心动图等临床资料,根据心电图结果分为窦性心律组(22例)房颤组与(26例)。在心脏瓣膜置换手术时切取右心耳心肌组织,用蛋白质印迹法(Western blot)测定病人心肌组织钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶(CaN)蛋白表达水平,以β-肌动蛋白(β-actin)为参照,所得条带灰度值比值作为蛋白表达的相对含量,再结合形态学检查及其他指标检查结果以确定两种蛋白表达与瓣膜性房颤发生的关系。结果两组年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、血压及血红蛋白含量指标差异均无统计学意义(P>0.05),但房颤组心率高于窦性心律组(P <0.05),房颤组二尖瓣面容比例明显高于窦性心律组(P <0.05);房颤组使用地高辛比例明显高于窦性心律组(P <0.05),但两组在服用利尿剂、β受体阻断药及其他内科药物方面差异无统计学意义(P>0.05);房颤组心胸比例、二尖瓣瓣口面积明显高于窦性心律组,差异具有统计学意义(P <0.05);超声检查窦性心律组左室射血分数值高于房颤组(P <0.05),房颤组左房内径较窦性心律组明显增大(P <0.05),比较两组左室内径、右室内径、室间隔厚度及左室后壁厚度时两组差异无统计学意义(P>0.05);房颤组心肌组织钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白表达水平均高于窦性心律组(P <0.05)。结论钙蛋白酶-2、钙调神经磷酸酶蛋白的表达可能影响了心脏及心脏瓣膜正常的形态学结构,进而引发了瓣膜性房颤。

钙激活中性蛋白酶2在口腔鳞状细胞癌中的表达及对肿瘤细胞生物学行为的影响

目的探究钙激活中性蛋白酶2(Calpain-2)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达及Calpain-2对肿瘤细胞生物学行为的影响。方法通过RT-PCR、Western blotting和免疫组织化学方法检测OSCC组织Calpain-2的表达,分析Calpain-2与临床病理的关系。利用敲低Calpain-2的OSCC细胞评价Calpain-2对细胞增殖、凋亡及迁移的影响。结果OSCC组织中Calpain-2表达水平升高(P<0.05)。Calpain-2敲低的OSCC细胞增殖能力和凋亡率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。敲低Calpain-2的表达能抑制OSCC细胞的迁移能力(P<0.05)。结论Calpain-2可能参与肿瘤细胞的迁移过程,有可能成为抑制肿瘤细胞迁移的重要靶点。

川芎嗪对人肝癌细胞钙激活中性蛋白酶-2、黏着斑激酶及迁移侵袭能力的影响

目的探讨川芎嗪(TMP)对人肝癌细胞钙激活中性蛋白酶(Calpain)-2、黏着斑激酶(FAK)及迁移侵袭能力的影响,以了解其抑制肝癌的机制。方法将人肝癌细胞(MHCC97-H)分为对照组和TMP组,TMP组予以TMP 1.0 mg/ml干预24 h,采用Western印迹检测两组Calpain-2、FAK蛋白表达情况,划痕实验、Transwell实验检测MHCC97-H迁移、侵袭能力。结果与对照组比较,TMP组Calpain-2、FAK蛋白表达均明显下调(P<0.05);其迁移率、穿膜细胞数及吸光度值均明显下降(P<0.05)。结论下调肝癌细胞系(MHCC97-H)的Calpain-2、FAK水平可能是TMP抗肝癌作用机制之一。

风湿性心脏病心房颤动患者左心房组织中钙蛋白酶-2含量与心肌细胞凋亡的相关性

目的检测风湿性心脏病心房颤动(房颤,AF)患者左房心肌细胞中钙蛋白酶-2(calpain-2)的表达水平及左房心肌细胞凋亡的发生率,探讨二者之间的关系和在AF发病机制中的作用。方法选择行外科心脏瓣膜置换手术的风湿性心脏病患者47例,分为窦性心律(NSR)组(20例)和心房颤动(AF)组(27例)。应用荧光实时定量PCR和免疫组织化学法半定量检测calpain-2的表达;利用TUNEL法检测各组患者左房心肌细胞凋亡率。计算其凋亡指数(AI),应用相关性分析分别分析其与前两者之间的关系。结果 AF组中calpain-2 mRNA[deltaCt值:(0.088±0.033)vs(0.065±0.020),P<0.05]及蛋白表达量[平均光密度值:(0.091±0.017)vs(0.062±0.007),P<0.01]及细胞凋亡水平[凋亡指数AI:(0.317±0.058)vs(0.131±0.069),P<0.01]明显高于NSR组,AF组calpain-2的mRNA转录水平与心房肌细胞凋亡率呈明显正相关(r=0.688,P<0.01),calpain-2的蛋白含量与心房肌细胞凋亡呈明显正相关(r=0.801,P<0.01)。结论风湿性心房颤动患者左房心肌细胞calpain-2蛋白的表达水平增高,细胞凋亡率升高,两者可能互相影响,致使心房重构,进而推动房颤的发生,可能是心房颤动形成的重要机制之一。

β-抑制蛋白2、钙中性蛋白酶2表达与乙型肝炎患者肝纤维化的相关性分析

目的探讨β-抑制蛋白2(β-arrestin 2)、钙中性蛋白酶2(calpain 2)表达与乙型肝炎(CHB)患者肝纤维化的相关性。方法选取2016年1月—2018年4月当阳市人民医院肝病感染科收治的接受肝穿刺组织病理活检的102例CHB患者作为CHB组,根据肝纤维化程度,分为轻度肝纤维化46例,重度肝纤维化30例,肝硬化26例。选取同期30例肝破裂患者作为对照组。比较各组间肝组织β-arrestin 2和calpain 2 mRNA和蛋白表达水平,血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层粘连蛋白(LN)水平,并进行相关性分析。结果CHB组肝组织β-arrestin 2和calpain 2 mRNA和蛋白表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。CHB组血清HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。肝硬化患者肝组织β-arrestin 2、calpain 2 mRNA表达及血清HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN水平高于轻度肝纤维化和重度肝纤维化患者,差异有统计学意义(P<0.05);重度肝纤维化患者肝组织β-arrestin 2、calpain 2 mRNA表达及血清HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN水平高于轻度肝纤维化患者,差异有统计学意义(P<0.05)。经过Pearson相关性分析,β-arrestin 2、calpain 2 mRNA表达与CHB患者肝纤维化指标均呈正相关(P<0.05)。结论β-arrestin 2、calpain 2与CHB患者肝纤维化程度密切相关,可为肝纤维化的病变过程提供参考依据,并且可能是潜在的辅助检测指标。

钙蛋白酶及其抑制蛋白在女性压力性尿失禁患者尿道周围组织中的表达

目的分析钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白在压力性尿失禁(SUI)患者尿道周围组织中的表达及定位,探讨两者在压力性尿失禁发病中起的作用。方法选取20例行阴道无张力尿道中段悬吊术的SUI患者(SUI组)和20例行阴道壁囊肿剥除术的非SUI患者(对照组),采用免疫组化En Vision染色法对两组患者尿道周围组织石蜡切片中钙蛋白酶-1、钙蛋白酶-2和钙蛋白酶抑制蛋白的表达区域及水平进行检测。结果 SUI组和对照组尿道周围组织中的上皮细胞、平滑肌细胞中均有钙蛋白酶-1、钙蛋白酶-2和钙蛋白酶抑制蛋白的表达,但间质细胞中未见这三种蛋白的表达。钙蛋白酶-1的表达水平在SUI组和对照组上皮细胞和平滑肌细胞中的表达分别为2.71±0.45 vs2.41±0.41,2.01±0.40 vs 2.09±0.43,两组间比较,差异均无统计学意义(t分别=1.80、-0.46,P均>0.05)。钙蛋白酶-2的表达水平在SUI组和对照组上皮细胞和平滑肌细胞中的表达分别为3.07±0.36 vs 2.67±0.47,2.50±0.42 vs 2.08±0.51,两组间比较,差异均有统计学意义(t分别=2.35、2.28,P均<0.05)。钙蛋白酶抑制蛋白的表达水平在SUI组和对照组上皮细胞和平滑肌细胞中的表达分别为2.91±0.42 vs 3.23±0.39,2.69±0.43 vs 3.09±0.45,两组间比较,差异均有统计学意义(t分别=-2.19、-2.35,P均<0.05)。结论钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白表达失衡可能参与压力性尿失禁的发生,钙蛋白酶-2对SUI的发病有促进作用,钙蛋白酶抑制蛋白对SUI的发病有保护作用。

Cav3.2基因在盆底电刺激治疗小鼠压力性尿失禁中的作用及其机制

目的:探讨Cav 3.2基因在盆底电刺激(PES)治疗小鼠压力性尿失禁(SUI)中的作用,并阐明其相关机制。方法:30只C57BL/6小鼠按干预措施随机分为对照组[未进行阴道扩张(VD)造模]、VD组(VD造模)和VD+PES组(VD造模联合PES),每组10只;按照基因型和干预措施将小鼠分为WT-VD组(野生型VD造模)、WT-VD+PES组(野生型VD造模联合PES)、KO-VD组(Cav 3.2敲除型VD造模)和KO-VD+PES组(Cav 3.2敲除型VD造模联合PES)。Masson染色观察各组小鼠尿道和阴道前壁组织中Ⅰ型胶原(ColⅠ)和Ⅲ型胶原(ColⅢ)的胶原纤维沉积情况和胶原纤维表达水平,测定各组小鼠尿动力学参数最大膀胱容积(MBC)和漏尿点压力(LPP),Western blotting法检测各组小鼠尿道和阴道前壁组织中整合素β1、钙蛋白酶2、ColⅠ和ColⅢ蛋白表达水平。结果:与VD组比较,VD+PES组小鼠尿道和阴道前壁组织中ColⅠ和ColⅢ胶原纤维表达水平明显升高(P<0.01);与WT-VD组比较,WT-VD+PES组小鼠尿道和阴道前壁组织中ColⅠ及ColⅢ胶原纤维表达水平明显升高(P<0.01);与WT-VD+PES组比较,KO-VD组和KO-VD+PES组小鼠尿道和阴道前壁组织中ColⅠ及ColⅢ胶原纤维表达水平明显降低(P<0.01)。与对照组比较,VD组小鼠MBC和LPP均降低(P<0.05);与VD组比较,VD+PES组小鼠MBC和LPP均升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与VD组比较,VD+PES组小鼠尿道和阴道前壁组织中ColⅠ及ColⅢ蛋白表达水平均明显升高(P<0.01);与WT-VD组比较,WT-VD+PES组小鼠尿道和阴道前壁组织中ColⅠ及ColⅢ蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与WT-VD+PES组比较,KOVD组和KO-VD+PES组小鼠尿道和阴道前壁组织中ColⅠ及ColⅢ蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与WT-VD组比较,WT-VD+PES组小鼠尿道和阴道前壁组织中整合素β1及钙蛋白酶2蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:PES可改善小鼠尿动力学功能,并通过Cav 3.2基因及其下游整合素β1和钙蛋白酶2促进盆底胶原的生成,促进盆底修复。

雌二醇通过Calpain 2有限水解integrinβ4促进乳腺癌SK-Br3细胞迁移浸润的相关机制

目的研究雌二醇通过calpain 2/integrinβ4促进人表皮生长因子受体(Her2)阳性的乳腺癌SK-Br3细胞迁移和浸润的相关机制。方法常规培养乳腺癌SK-Br3细胞,calpain 2的特异性抑制剂或雌二醇(E2)处理细胞,并对汇合度为60%(低密度)和90%(高密度)的细胞进行培养;通过细胞划痕实验检测SK-Br3细胞的迁移能力,Transwell-Matrigel实验检测SK-Br3细胞的浸润能力,免疫细胞化学技术和激光共聚焦扫描显微镜观察integrinβ4和Her2的表达与共定位,免疫共沉淀技术检测integrinβ4和Her2的相互作用,Western blot技术检测相关蛋白或蛋白片段的表达及蛋白磷酸化水平。结果划痕和浸润实验显示,相对于对照组,Calpain2抑制剂处理的SK-Br3细胞迁移和浸润能力减弱(P<0.05);免疫细胞化学成像显示,Her2和integrinβ4的共定位主要在细胞膜上,在胞浆也有少量共定位,用calpain inhibitorⅣ处理后,Her2和integrinβ4的表达减少,共定位也明显减少;免疫共沉淀实验发现,在Her2免疫沉淀物中可检测到integrinβ4,在integrinβ4免疫沉淀物中可检测到Her2;给予calpain inhibitorⅣ处理,可以减少Her2和integrinβ4之间的免疫共沉淀;Western blot检测发现,高密度培养乳腺癌SK-Br3细胞中的integrinβ4比低密度培养的水解程度高;在高密度培养条件下,E2可以促进这些integrinβ4水解片段的产生,上调calpain 2的表达,也伴随着integrinβ4水解程度的增加,同时使Src的Y418位点的磷酸化水平增高。结论高密度培养条件下,E2可通过上调和激活calpain2,促进integrinβ4的有限水解,促进integrinβ4和Her2的相互作用,磷酸化激活Src,促进SK-Br3细胞的迁移和浸润。

心房颤动病人IL-1β、Calpain-2水平与心脏结构重构的相关性研究

目的:探讨心房颤动(房颤)病人血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、钙蛋白酶-2(Calpain-2)表达水平及与心脏结构重构的相关性。方法:选取确诊为房颤的病人150例为观察组,依据2020年ESC/EACTS房颤诊断和管理指南将其分为非阵发性房颤组和阵发性房颤组;选取同时段健康体检者120名作为对照组。分别检测血清IL-1β、Calpain-2以及超声心动图中左心室舒张期内径(LVDd)、左心房内径(LAD)、左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(FS)等指标,比较3组不同指标是否存在差异;运用Pearson相关性分析血清IL-1β、Calpain-2与超声心动图检查结果的相关性;采用二元logistic回归分析,探寻房颤的危险因素。结果:观察组中IL-1β、Calpain-2含量显著高于对照组(P<0.05),而且非阵发性房颤病人明显高于阵发性房颤病人(P<0.05)。在超声心动图指标中非阵发性房颤组LAD、LVDd均高于阵发性房颤组以及对照组(P<0.05),LVEF、FS均低于阵发性房颤组及对照组(P<0.05)。二元logistic回归分析显示IL-1β、Calpain-2是房颤发生的危险因素。Spearman相关性分析显示IL-1β、Calpain-2与LAD、LVDd呈正相关关系(P<0.01),而与LVEF、FS呈显著负相关关系(P<0.01)。结论:IL-1β、Calpain-2与LAD、LVDd呈正相关关系,参与了心脏结构重构过程,进而促进了房颤的发生与发展。

二硫苏糖醇通过激活calpain-2/caspase-12信号通路诱导BRL-3A细胞凋亡

目的:探讨二硫苏糖醇(DTT)诱导大鼠正常肝细胞株BRL-3A发生内质网应激时细胞内葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、钙蛋白酶2 (calpain-2)、caspase-12及caspase-3的表达变化及对细胞凋亡的影响。方法:采用2. 5 mmol/L DTT分别处理BRL-3A细胞12 h和24 h,应用real-time PCR检测细胞内GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的mRNA水平;采用细胞免疫荧光检测细胞内GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的蛋白表达;应用Western blot检测cleaved caspase-12及cleaved caspase-3的表达变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:BRL-3A细胞经DTT处理12 h及24 h后,GRP78、calpain-2及caspase-12的mRNA表达较正常对照组显著升高(P <0. 01),而caspase-3的mRNA水平与正常对照组比较无显著变化;细胞免疫荧光及Western blot检测发现,DTT处理细胞12 h及24 h后,BRL-3A细胞内GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的蛋白表达均较正常对照组显著增高,同时,cleaved caspase-12及cleaved caspase-3的表达也较正常对照组明显增多(P <0. 05);流式细胞术检测发现,经DTT处理后BRL-3A细胞的凋亡率较正常对照组显著增加(P <0. 05)。结论:二硫苏糖醇诱导BRL-3A细胞凋亡可能与calpain-2/caspase-12信号通路激活有关。

风湿性心房颤动患者左心房组织中钙蛋白酶-2的表达

目的观察风湿性心房颤动(AF)患者左心房中钙蛋白酶-2(calpain-2)的表达,探讨其在AF发病机制中的作用。方法选取外科换瓣手术的风湿性心脏病患者39例,分为窦性心律组(n=16例)和心房颤动组(n=23例)。应用RT-PCR技术和免疫组化LSAB法半定量检测calpain-2的表达。结果心房颤动组calpain-2 mRNA的deltaCt值高于窦性心律组[(0.091±0.035)vs(0.066±0.022),P=0.017];两组左心房心肌细胞中均有棕黄色颗粒沉着,心外膜和心内膜细胞均未见棕黄色颗粒;心房颤动组中calpain-2表达含量明显高于窦性心律组(P<0.001),两者平均光密度值分别为0.92±0.17和0.65±0.01;calpain-2的含量与左心房收缩末期直径呈正相关(r=0.929,P<0.001)。结论 calpain-2在人类左心房心肌细胞中表达;AF时calpain-2的表达明显增加。

丹芍化纤胶囊对肺纤维化大鼠肺组织中calpain2,NF-κB及p38MAPK表达的影响

目的观察博莱霉素致大鼠肺纤维化中calpain2、NF-κB p50蛋白及p38MAPK表达的变化及中药丹芍化纤胶囊对其表达的影响。方法选取SD大鼠30只,随机分为正常对照组(正常组)、肺纤维化模型组(模型组)和丹芍化纤胶囊治疗组(丹芍组),每组各10只。正常对照组气管内滴注生理盐水,模型组和丹芍组气管内一次性灌注博莱霉素5 mg/kg诱导肺纤维化,丹芍组于造模第2天给予丹芍化纤胶囊混悬液灌胃(0.8 g.kg-1.d-1)治疗,正常组及模型组则给予等量生理盐水灌胃。实验第28天称大鼠体重,处死各组大鼠,称肺湿重并收集肺组织,行HE和Masson染色观察肺组织病理变化;采用免疫组织化学的方法检测肺组织中calpain2、NF-κB p50蛋白及p38MAPK蛋白的表达情况;运用荧光实时定量PCR(real-time PCR)检测肺组织中calpain2及p38MAPK mRNA的表达变化。结果①与正常组比较,模型组大鼠肺组织中calpain2,NF-κB p50和p38MAPK蛋白表达明显升高,且calpain2及p38MAPK mRNA的表达也显著增加。②与模型组相比,丹芍组大鼠肺组织中calpain2,NF-κBp50,p38MAPK蛋白表达及calpain2,p38MAPK mRNA的表达均显著减少,但未恢复正常水平。结论丹芍化纤胶囊早期应用可在一定程度上减轻博莱霉素诱导的肺泡炎症反应及肺纤维化进展,对肺纤维化具有一定的治疗作用。丹芍化纤胶囊对肺纤维化的干预机制可能与其抑制肺组织中calpain2,NF-κBp50和p38MAPK的表达有关。