长期自主转轮跑运动对小鼠脾淋巴细胞钙稳态,IL-2分泌及钙调基因表达的影响

目的:通过构建动物模型,研究运动对淋巴细胞钙稳态、IL-2分泌及钙调基因表达影响,以探讨长期适量强度运动调控免疫机能的分子机制。方法:相互匹配雄性小白鼠随机被分成控制组和实验组,实验组执行长期自主转轮跑运动6个月,淋巴细胞分离自小鼠脾脏,胞内钙离子浓度通过荧光稳态/瞬态分析系统测量荧光探针负载细胞悬液而确定,ELISA法检测Con A体外刺激对淋巴细胞分泌IL-2水平的影响,实时荧光定量PCR法检测细胞相关钙调基因表达。结果:不管在含钙缓冲液还是在不含钙PBS溶液中,实验组OKT-3诱导淋巴细胞内钙离子浓度变化幅度显著高于控制组(P<0.05,n=5);实验组Con A体外刺激诱导培养细胞IL-2分泌水平显著高于控制组(P<0.05,n=6);实验组淋巴细胞内钙调节基因STIM1和ORAI1核酸表达水平显著低于控制组(P<0.05,n=5)。结论:长期自主转轮跑运动可促进小鼠脾淋巴细胞钙离子信号转导敏感性,提高体外刺激诱发淋巴细胞分泌IL-2水平,推测胞内钙稳态调控基因表达下调可能是一种负反馈机制,以防止运动诱发的胞内钙稳态失衡,当然这仍需进一步的实验深入研究运动的调控机理。

聚合酶链式反应扩增甘蔗钙调蛋白基因及其序列分析

从甘蔗茎顶端分生组织提取总RNA,反转录合成CDNA第一条链,以此为模板,参考大麦钙调蛋白基因序列设计并合成5′端和3′端引物,PCR扩增甘蔗钙调蛋白基因,与克隆载体PGEM—3Zf(十)重组,转化E.coli HB101得到重组克隆.DNA序列分析结果表明;甘蔗钙调蛋白基因由450个核甘酸组成,编码148个氨基酸;在核甘酸序列上与迄今知道的几种植物的钙调蛋白基因有很高的同源性,同源率在80%以上;编码的氨基酸序列同源性更高,同源率高达90%以上.

新疆盐生植物的钙调蛋白基因克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从新疆盐生植物花花柴(Karelinia caspica)、盐爪爪(Kalidium foliadum)和盐桦(Betulahalophila)中分别克隆获得了450bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析的结果表明,所克隆的基因片段均包含了钙调蛋白基因完整的读码框架。新疆花花柴钙调蛋白基因与盐爪爪钙调蛋白基因同源性达86%,盐爪爪与盐桦同源性达86.77%,花花柴与盐桦同源性达85.11%。新疆盐生植物钙调蛋白基因与其它已发表的植物钙调蛋白基因同源性均在80%以上,显示植物钙调蛋白基因具有高度保守性。

白念珠菌钙调蛋白基因单点突变重组质粒的构建和鉴定

目的 :构建白念珠菌钙调蛋白基因 (CMD1)单点突变重组质粒 ,为进一步探讨 CMD1突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法 :采用 PCR定点突变法 ,将 CMD1编码 C端 3个苯丙氨酸 (F89、F92和 F141)的碱基分别定点突变成编码丙氨酸的碱基 ,构建 CMD1单点突变重组表达质粒 ,并进行序列测定。结果 :测序结果证实 ,所构建的 3个重组质粒均含有相应的 CMD1定点突变后的序列 ,F89+:TTC→ GCT;F92 +:TTT→ GCC;F141+:TTT→ GCC。 结论 :成功构建了 3个CMD1单点突变重组表达质粒 ,为后续研究奠定了基础。

红树植物拟海桑钙调蛋白基因的克隆及分析

钙调蛋白 (Calmodulin)是生物细胞内一种重要的调控蛋白 ,通过其与靶酶的相互作用控制细胞正常的生长和发育 .作者以高抗盐红树植物海桑属拟海桑 (Sonnera tiaparacaseolaris)总DNA为模板 ,参考GenBank上植物钙调蛋白基因序列合成 5′端和 3′端引物 ,利用多聚酶链式反应 (PCR)扩增了拟海桑钙调蛋白基因 ,与克隆载体pBsk(+)重组 ,转化EscherichiacoliDH5α得到重组克隆子 ,DNA序列分析表明 ,所得片段的编码区在核苷酸序列上与迄今已知的几种植物钙调蛋白基因有很高的同源性 ,同源率在 85%以上 ;与水稻、苹果、衣藻等相似 ,其基因编码区被一个位于第 75位核苷酸之后的内含子所中断 .

甜菊钙调蛋白基因的克隆及结构分析

钙调蛋白 (Calmodulin)是生物细胞内一种重要的调控蛋白 ,通过其与靶酶的相互作用控制细胞正常的生长发育及细胞对外界环境变化的反应 .我们从甜菊顶芽和花芽中提取总RNA ,逆转录合成cDNA第一链 ,以此为模板 ,参考GenBank上已发表植物的钙调蛋白基因序列合成 5’端和 3’端引物 ,利用多聚酶链式反应 (PCR)扩增并克隆得到了甜菊钙调蛋白基因的两个异型基因 .序列分析表明 ,它们均由 4 5 0个核苷酸组成 ,编码 14 8个氨基酸 .在核苷酸序列上与迄今已知的多种植物钙调蛋白基因均有很高的同源性 ,同源率在 83%以上 ,编码的氨基酸序列同源性更高 ,同源率高达 95 %以上 .这两个基因之间存在差异 ,其核苷酸序列同源率为 85 % ,编码区的氨基酸序列的同源率为 99% ,仅在第 12

亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆和生物信息学分析

目的从亚洲带绦虫（Taenia asiatica）成虫cDNA文库中克隆亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因（calci—neurinB），并分析和预测其编码蛋白的结构和功能。方法构建亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库，从文库中识别钙调神经磷酸酶B基因并进行生物信息学分析和登录。结果该基因登录号为ABN14963．1，是全长基因，长度747bp，编码区为56～563，编码169个氨基酸；无跨膜区，蛋白的理化性质稳定；含有4个“EF—hand”Ca^2＋结合区域；与Gen—Bank中日本血吸虫同源基因的一致性达90％，相似性达95％；预测3个主要的抗原表位99～104、20～25、23～28在钙调神经磷酸酶B蛋白空间结构的分子表面。结论应用生物信息学方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出一个钙调神经磷酸酶B基因。

甘蔗钙调蛋白基因的克隆及序列分析

从甘蔗（ＳａｃｃｈａｒｕｍｓｐｅｃｉｃｓｈｙｂｒｉｄＣＶ．）茎顶端分生组织分离总ＲＮＡ，经反转录合成ｃＤ－ＮＡ第一条链，以此为模板进行多聚酶链式反应（ＰｏｌｙｍｃｒａｓｅＣｈａｉｎＲｃａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ），产物为一长为４５０ｂｐ的ＤＮＡ片段。经克隆及序列测定表明，其核苷酸序列及所推导的氨基酸序列，与其他植物的钙调蛋白（ＣａｌｍｅｄｕｌｉｎＣａＭ）基因的核苷酸序列及所编码的氢基酸序列，具很高的同源性。

一个钙调蛋白类基因对拟南芥叶片气孔分布的影响

以一个缺磷胁迫诱导的钙调蛋白类基因AtPsiCaM为研究对象,采用拟南芥浸润转基因方法获得了AtPsiCaM基因的35S增强转基因植株。经Northern杂交检测表明,在AtPsiCaM基因的增强转基因株系中,该基因的转录水平明显增强。实验结果表明AtPsiCaM基因降低了增强转基因植株叶片的气孔指数和气孔导度,并且影响了植株的气孔分布。

亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因的原核表达和免疫学分析

【目的】对亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因(CaN)进行克隆、表达和免疫学初步研究。【方法】将亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。【结果】PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-30a(+)-Ta CaN构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因能在大肠杆菌BL-21/DE3中表达,经亲和层析得到了纯化重组蛋白。重组蛋白能被感染了亚洲牛带绦虫的猪和患者的血清识别。【结论】亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达。为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。

黑鲷钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)基因克隆及表达差异

钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)为参与细胞内pH及细胞增殖调控的关键因子。用RACE末端PCR方法得到黑鲷CHP2(AsCHP2)基因全长cDNA,并利用生物信息学方法分析该基因的序列特征与同源性;同时利用实时荧光定量PCR方法检测AsCHP2的mRNA在黑鲷整体仔鱼,90d、180d黑鲷,杂交F_(2)(真鲷♂×黑鲷♀)及回交F_(1)(黑鲷♂×杂交F_(1)♀)的脑、心脏、肌肉、肝脏和性腺等组织中的表达。研究结果表明:(1)AsCHP2cDNA序列全长1722bp,5'-非编码区(UTR)长度69bp,3'-UTR长度1069bp,开放阅读框长度为585bp,编码194个氨基酸;其结构域包含2个EF-hand结构及1个核输出信号;其蛋白分子质量为21.87ku,理论等电点为4.89;同源建模获得了CHP2的二级与三维结构。AsCHP2基因的核苷酸序列与其他鱼类的相似性为86%~81%,编码的氨基酸序列与其他鱼类的相似性为80%~72%。邻接系统树显示了黑鲷CHP2氨基酸序列与其他鱼类的进化关系。序列比对与结构分析表明,AsCHP2基因具有典型的CHP2基因结构。(2)AsCHP2的mRNA在黑鲷的仔鱼期(5~35d)及大规格个体的脑、肝脏及肌肉组织中均有表达,在90d个体各组织中的表达量均高于在180d个体各组织中的表达量;在180d黑鲷、杂交F_(2)及回交F_(1)的个体中,基因在脑、肝脏、肌肉及性腺等不同组织中均有表达,且均在心脏中高表达、在性腺中低表达。这些结果显示,CHP2基因在海水鱼类的生长、发育过程中发挥功能。

无瓣海桑Sonnerati aapertala钙调蛋白基因的克隆及序列分析

用高等植物钙调蛋白的保守序列设计两端引物 ,以红树植物海桑属无瓣海桑Sonneratiaapertala总DNA为模板 ,扩增出无瓣海桑钙调蛋白基因 ,并以之构建重组质粒pT ACaM .经测序分析比对 ,发现无瓣海桑钙调蛋白基因全长 1418bp ,其中第 1外显子 76bp ,第 2外显子 371bp ,中间为一 946bp的内含子所隔开 .编码 148氨基酸的蛋白质 ,其编码区序列与已知的其他高等植物的钙调蛋白基因核苷酸序列同源性高达 85 %以上 .而蛋白质序列同源性达95

微小隐孢子虫类钙调蛋白基因的克隆与原核表达

为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。

赛庚啶对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴钙调蛋白基因表达的影响

赛庚啶 (cyproheptadine ,Cyp)为临床常用抗组胺药 ,并具有阻断 5 HT受体和抗胆碱作用。新近研究发现Cyp可使大鼠血清促甲状腺激素 (TSH) ,三碘甲状腺原氨酸 (T3) ,甲状腺素 (T4 )含量降低 ,同时电镜观察TSH细胞有明显的退行性改变 ,另外实验初步观察到Cyp使垂体促性腺细胞也出现明显的超微结构改变。由此可见Cyp对机体的内分泌系统可能有广泛的作用。钙调蛋白 (calmodulin ,CaM)作为一种多功能的调节蛋白广泛分布于脑和一些内分泌器官中 ,并与下丘脑 垂体 靶腺轴的功能活动密切相关。本研究采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法及荧光定量PCR技术研究了Cyp对大鼠下丘脑 腺垂体 肾上腺皮质轴 (hypothalamus pituitary adrenalcortexaxis,HPAA)CaMmRNA表达的影响。选用雄性SD大鼠 ,体重 2 0 0～ 2 5 0g。以大鼠CaMmRNA和 β 肌动蛋白mRNA扩增产物量 (Ct)的比值来衡量大鼠CaMmRNA的表达情况 ,Ct值即Cyclethreshold ,含义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 ,Ct值越小样本中的起始拷贝数越高。结果表明 ,下丘脑 ,垂体 ,肾上腺CaMmRNA的表达在实验组分别为 ( 1.184± 0 .0 2 3 ) ,( 1.192± 0 .0 2 6) ,( 1.2 2 8± 0 .0 2 6) ,在对照组分别为 ( 1.15 2± 0 .0 2 0 ) ,( 1.12 5± 0 .

基因重组钙调蛋白提取纯化的新方法

目的建立一个简捷高效的纯化基因重组钙调蛋白(Recombinant-calmodulin,CaM)的新方法。方法 培养CaM基因重组大肠杆菌,并用IPTG诱导CaM表达,将菌体冻融、超声破碎,再经三氯醋酸、硫酸铵沉淀及超速离心,获得CaM;经SDS-PAGE检测CaM的纯度与相对分子质量,用甘油电泳和Scoin Image密度扫描软件检测CaM激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK),从而引起肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化的活性。结果SDS-PAGE显示,重组大肠杆菌表达了大量CaM,且所提取CaM的相对分子质量及纯度均与CaM标准品一致;甘油电泳结果显示,CaMO.1μg/ml即可激活MLCK,使MLC20部分磷酸化,至3μg/ml时使MLC20双重磷酸化,其所致磷酸化的程度与等剂量的CaM标准品基本相同。Scoin Image密度扫描结果显示,CaM激活MLCK引起MLC20磷酸化的百分率与等剂量CaM标准品差异无显著意义(P>0.01)。结论已建立了简捷高效纯化CaM的新方法。

香蕉钙调蛋白基因的克隆及序列分析

从香蕉（ＭｕｓａｎａｎａＬｏｕｒ，）果实中提取总ＲＮＡ，以ＯｌｉｇｏｄＴ（１８ｂｐ）为引子合成ｃＤＮＡ第一链，以大麦钙调蛋白基因两端的寡聚核苷酸为引物，用ＰＣＲ方法扩增香蕉钙调蛋白基因，并克隆到ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ－载体上。酶切分析和测定ＤＮＡ全序列，将该序列与几种植物的钙调蛋白基因作比较，同源性高达８１．９％－９５．３％。进一步将基因克隆到表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＢ上，得到高效表达的融合蛋白。

RNA干涉方法在拟南芥钙调蛋白类基因研究中的应用

以拟南芥芯片杂交分析中发现的一个低磷条件下诱导的钙调蛋白类基因AtPsiCaM为研究对象,通过RNA干涉使该基因沉默,获得AtPsiCaM基因的转基因干涉植株,以期对该基因进行进一步的功能研究。

Ⅱ型钙调蛋白激酶δ亚基基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达及肿瘤坏死因子-α调控作用

目的观察3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中Ⅱ型钙调蛋白激酶δ亚基基因表达水平及肿瘤坏死因子-α对成熟脂肪细胞中Ⅱ型钙调蛋白激酶δ亚基((2AMKⅡD)基因表达的调控作用。方法检测3T3-L1前体脂肪细胞体外诱导分化不同时段CAMKⅡD基因的mRNA表达水平;采用不同浓度TNF-α干预成熟脂肪细胞,检测干预后不同时间点CAMKⅡD基因的表达水平。结果3T3-L1前体脂肪细胞中CAMKⅡD基因mRNA表达,于d1显著下调,与d0比较具有显著差异(P< 0.01);d2其表达水平显著上调,并明显高于d0表达水平(P<0.01);d2-10表达一直维持在较高水平(P>0.05)。0.1、1.0 μg/L的TNF-α干预后,成熟脂肪细胞该基因各时段的表达水平无显著变化(P>0.05);10.0 μg/L的TNF-α干预后,在12 h 始,其表达水平有显著性下调(P<0.01);其他各时段之间无显著变化(P>0.05)。结论CAMKⅡD基因参与脂肪细胞分化的调控,与肥胖发生相关,其在3T3-L1细胞分化过程中的表达变化可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚。TNF-α对成熟脂肪细胞中CAMKⅡD基因表达可能不具有调控作用。

基于CODEHOP的欧李钙调蛋白基因片段的克隆

为克隆欧李钙调蛋白基因序列,本研究采用CODEHOP方法设计了一对简并引物,F1:5'-GGCTGACCAACTGACCga(c/t)ga(c/t)ca(a/g)at-3';F2:5'-CACGTCAGCCTCTCTGatcat(c/t)tc(a/g)tc-3';并采用传统简并引物设计方法设计了简并引物N1:5’-AAATGGC(A/C/G)GATCAGCT(A/C/T)AC-3’;N2:5:’-CACTT(A/G)GCCATCATGAC(C/T)TT-3’.从欧李的幼苗组织中成功克隆出了钙调蛋白基因片段,并第一次完成了对该序列的测序.通过利用NCBI的Blast进行分析等方法证实了该序列与其他植物的钙调蛋白序列具有高度的同源性,该序列与梅花、桃、甜樱桃的钙调蛋白序列同源性都在90%以上.研究证明CODEHOP软件相比传统的设计简并引物的方法具有可信性和高效性,并且钙调蛋白目的基因的成功克隆对钙调蛋白以及欧李高钙特性的研究提供了基础数据.