小菜蛾钙黏蛋白PxCR_(10-11)结构域的克隆、原核表达及功能分析

钙黏蛋白(cadherin)是一类跨膜糖蛋白,因其在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的杀虫过程中作为主要的受体而受到广泛研究.钙黏蛋白的特征之一是由若干钙黏蛋白重复单元(cadherin repeats,CR)组成的长链状蛋白,其中靠近细胞膜的CR结构域被认为是钙黏蛋白与Bt毒素发生互作的区域.小菜蛾(Plutella xylostella)钙黏蛋白由11个CR结构域和1个跨膜结构域组成,其中第10和11个CR结构域PxCR_(10-11)被认为是钙黏蛋白与Bt毒素的互作区域.本研究从小菜蛾中肠cDNA中克隆得到小菜蛾钙黏蛋白PxCR_(10-11)结构域的DNA片段,并通过原核表达系统对PxCR_(10-11)结构域进行表达.配体印迹结果表明PxCR_(10-11)可以特异性和Cry2Ab结合;杀虫实验结果表明PxCR_(10-11)能提高Cry2Ab对小菜蛾的毒力.此外,利用蛋白质同源建模和糖基化位点预测网站对PxCR_(10-11)蛋白质结构进行了分析.上述结果表明PxCR_(10-11)可能参与了Cry2Ab毒素对小菜蛾的毒杀过程,为后续研究小菜蛾钙黏蛋白和Cry2Ab的相互作用机制奠定了基础.

厚壳贻贝转凝蛋白类贝壳基质蛋白的重组表达与功能分析

为探明从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)贝壳肌棱柱层中鉴定的一种新型贝壳基质蛋白——转凝蛋白类蛋白(transgelin-like protein,TLP)在贝壳形成过程中可能的分子机制,在序列分析基础上,对厚壳贻贝TLP进行原核重组表达及其表达产物的纯化,并分析其对方解石型和文石型碳酸钙晶体形貌的诱导作用及对晶型的影响,同时,分析其对2种晶型碳酸钙晶体结晶速度的抑制及结合作用。序列分析结果显示,厚壳贻贝TLP含有一段钙调理蛋白同源(calponin homology,CH)结构域,其三级结构以α-螺旋结构域为主。功能分析结果表明,重组厚壳贻贝TLP能诱导方解石型和文石型碳酸钙晶体在形貌上产生变化,其中:对方解石型碳酸钙晶体的晶型具有向文石型转化的作用,但对文石型碳酸钙晶体的晶型无影响。重组TLP对方解石型碳酸钙晶体的结晶速度具有明显的抑制作用,而对文石型碳酸钙晶体的结晶速度在蛋白质量浓度较高时具有促进作用。此外,重组TLP具有结合方解石型碳酸钙晶体的作用,但与文石型碳酸钙晶体无明显结合。以上结果表明,TLP对贝壳的形成具有影响并可能在贝壳肌棱柱层的形成中起到了重要作用。

LRCH1维持狼疮肾炎模型小鼠调节性T细胞的功能

目的探讨富含亮氨酸的重复序列和钙调理蛋白同源域1(LRCH1)在狼疮肾炎模型小鼠调节性T细胞(Tregs)中的表达和功能。方法6月龄C57BL/6小鼠和MRL/lpr小鼠,用流式细胞仪分选脾脏和肾脏内的CD45^(+)CD4^(+)CD25^(+)CD127^(low) Tregs,RT-qPCR检测Tregs LRCH1 mRNA水平。过继输注外源性Tregs至C57BL/6小鼠和MRL/lpr小鼠体内,RT-qPCR检测受者小鼠脾脏和肾脏内外源性Tregs LRCH1、IL-10和TGF-β的表达。用siRNA转染Tregs干扰Lrch1的表达。然后,用流式细胞仪检测Tregs对传统T细胞增殖的抑制功能;以免疫印迹法检测IL-2信号途径的活化。结果与野生型小鼠相比,MRL/lpr小鼠肾脏内的Tregs的LRCH1 mRNA增高4.13倍(P<0.05)。过继输注实验显示,狼疮肾炎微环境诱导Treg细胞的LRCH1表达升高1.98倍(P<0.05),IL-10和TGF-β的表达升高13.83和3.58倍(P<0.05)。Lrch1沉默使IL-2刺激下的p-STAT5降低约50%(P<0.05),导致IL-2信号转导受抑制,Foxp3表达下降,削弱了Tregs对传统T细胞增殖的抑制效应。结论LRCH1对狼疮肾炎模型小鼠浸润性Tregs的免疫抑制功能有正调控作用。