miR-103靶向钙调磷酸酶调节蛋白1对糖尿病肾病足细胞损伤的影响

目的探讨微小RNA-103(miR-103)在高糖诱导足细胞损伤中的作用及其可能的分子机制。方法本研究从2018年1月至2019年1月期间,体外培养人足细胞(HPC),以高糖刺激足细胞6、12、24 h,qRT-PCR与Western blotting分别检测高糖刺激下HPC细胞miR-103、钙调磷酸酶调节蛋白1(RCAN1)表达;采用ELISA检测白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;流式细胞仪检测细胞凋亡率。检测干扰miR-103的表达及RCAN1过表达后细胞凋亡率及IL-6、TNF-α水平变化;双荧光素酶报告基因检测验证miR-103与RCAN1的靶向调控关系。结果高糖诱导的足细胞中miR-103的表达量升高[(1.00±0.07)比(4.51±0.34)](P<0.05),而RCAN1表达水平降低[mRNA(1.00±0.08)比(0.59±0.06);蛋白(0.86±0.05)比(0.36±0.04)](P<0.05),足细胞凋亡率增加[(5.31±0.52)%比(24.36±1.58)%](P<0.05),IL-6、TNF-α水平升高[(7.23±0.33)ng/mL比(18.84±0.85)ng/mL;(0.34±0.03)ng/mL比(0.95±0.07)ng/mL](P<0.05);干扰miR-103的表达及RCAN1过表达后,足细胞凋亡率降低[(22.87±1.55)%比(14.72±0.82)%;(22.76±1.14)%比(13.88±0.85)%](P<0.05),IL-6[(18.54±0.62)ng/mL比(12.74±0.44)ng/mL;(19.74±0.61)ng/mL比(14.87±0.56)ng/mL]、TNF-α[(0.92±0.05)ng/mL比(0.54±0.06)ng/mL;(0.90±0.06)ng/mL比(0.56±0.04)ng/mL]水平降低(P<0.05);miR-103与RCAN1存在靶向关系,miR-103能够负向调控RCAN1的表达与活性;干扰RCAN1的表达部分逆转干扰miR-103的表达对高糖刺激足细胞的保护作用。结论干扰miR-103的表达可通过促进RCAN1的表达而减轻糖尿病肾病足细胞损伤。

条件恐惧记忆形成中大鼠海马CA1区钙调蛋白激酶Ⅱ和蛋白磷酸酶1蛋白表达及活性变化

目的探讨大鼠恐惧记忆形成过程中海马CA1区钙调蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)和蛋白磷酸酶1(PP1)表达的变化。方法将大鼠随机分成电击组(n=9)和对照组(n=9),24 h后处死动物,提取海马CA1区蛋白,用anti-CAMKⅡ、anti-p-CAMKⅡ(T286)和anti-PP1、anti-PP1α(T320)抗体作蛋白印迹,检测电击对CAMKⅡ和PP1蛋白表达及活性的影响。结果电击组的大鼠在1 h和24 h海马CA1区CAMKⅡ蛋白表达较对照组增加了4.4±1.2倍,并且其286位的苏氨酸磷酸化的CAMKⅡ蛋白表达较对照组增加了3.3±0.8倍(P<0.05)。电击组PP1蛋白表达较对照组增加了3.6±1.1倍,并且PP1α320位的苏氨酸磷酸化信号较对照组增加2.3±0.6倍(P<0.05)。结论大鼠条件恐惧记忆形成过程中海马CA1区CAMKⅡ和PP1蛋白的表达增加,活性增强。CAMKⅡ和PP1介导的磷酸化信号参与了条件恐惧长时记忆的形成。

敲低钙调磷酸酶结合蛋白1引起肾小管上皮细胞线粒体损伤

目的探讨钙调磷酸酶结合蛋白1(calcineurin binding protein 1, Cabin1)在肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)线粒体损伤中的作用机制。方法采用siRNA干预体外培养RTECs,敲低Cabin1的表达,继而以电镜观察其对RTECs线粒体形态的影响。结果在对照组和阴性对照组中Cabin1蛋白在RTECs中有高表达,采用siRNA干预RTECs后,Cabin1蛋白的表达量较对照组和阴性对照组降低50%以上(P<0.05)。对照组与阴性对照组中,线粒体形态规则,呈圆形或椭圆形,线粒体膜完整,线粒体嵴清晰可见。敲低组中,线粒体肿胀,呈长条形或不规则形,线粒体膜、线粒体嵴结构模糊甚至消失。结论敲低Cabin1引起RTECs的线粒体形态学异常,提示Cabin1是维持RTECs线粒体正常功能的重要分子。

大豆类钙调磷酸酶B亚基GmCBL1互作候选蛋白的筛选

Ca2+是非生物胁迫信号转导途径中的重要信号分子,植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL,calcineurin B-like proteins)是一类重要的钙信号受体蛋白,主要通过与其他蛋白的特异结合传递信号,使植物形成对非生物胁迫的响应。本实验室已经获得大豆Gm CBL1基因,功能鉴定显示Gm CBL1增强了转基因拟南芥对非生物胁迫的耐性。为了进一步研究Gm CBL1的作用机理,本研究构建诱饵载体p GBKT7::Gm CBL1,利用酵母双杂交技术筛选大豆Gm CBL1的互作蛋白。通过对筛选获得的106个蛋白基因测序和Blast比对分析,并根据其可能的生理功能对这些候选蛋白归类,整理得到4类蛋白:能量代谢相关蛋白、修饰蛋白、防御蛋白、钙信号转导相关蛋白。筛选得到候选蛋白的功能预测初步表明,大豆Gm CBL1参与多条信号途径,为进一步研究探索大豆CBL介导的抗逆信号转导途径奠定了基础。

钙调磷酸酶结合蛋白1在5/6肾切除大鼠肾小管上皮细胞损伤时高表达

目的探讨钙调磷酸酶结合蛋白1(calcineurin binding protein 1,Cabin1)在肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)损伤中的作用。方法雄性SD大鼠随机分成假手术组和5/6肾切除组,后者进一步分成术后4和8周组。肾切除后4和8周检杀大鼠,取肾组织行Masson染色和肾小管-间质损伤评分(tubulointerstitial lesion score,TILS),电镜观察RTECs线粒体形态,WB检测肾组织中Cabin1表达。结果随造模时间延长,术后8周出现RTECs脱落、间质炎症细胞浸润及弥漫性纤维化;TILS逐渐升高,术后8周组与假手术组相比,差异具有统计学意义(7.16±0.52 vs.0.00±0.00,P<0.05)。术后4周RTECs线粒体肿胀、形状不规则,术后8周出现线粒体膜、线粒体嵴结构模糊甚至消失。残肾中Cabin1蛋白表达明显升高,术后8周与假手术组(0.97±0.09 vs.0.22±0.07)、术后8周与4周组相比(0.97±0.09 vs.0.45±0.03),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Cabin1在RTECs损伤时高表达,其可能是调控RTECs损伤的重要靶点。

钙调磷酸酶结合蛋白1在足细胞线粒体损伤中的表达

目的探讨钙调磷酸酶结合蛋白1(Cabin1)在足细胞线粒体损伤中的作用机制。方法采用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激体外培养足细胞,分刺激后0、24和48 h组,行免疫荧光和WB检测Cabin1在足细胞线粒体损伤时的分布及表达。结果 0 h组,细胞骨架分子F-actin呈强有力的丝状分布,Cabin1均匀分布于胞浆和胞核;24 h组,F-actin出现不连续分布,Cabin1在胞浆的分布减少,趋向胞核分布;48 h组,F-actin排列明显紊乱,Cabin1在胞核的聚集更显著。24 h和48 h组,线粒体功能指示分子-细胞色素C蛋白分别为0 h组的1.51和1.87倍,Cabin1则分别达0 h组的1.33和1.67倍(P<0.05)。结论 Cabin1在足细胞细胞骨架破坏和线粒体损伤时表达升高,可能是调控足细胞线粒体功能的重要分子。

球囊扩张术后大鼠腹主动脉钙调神经磷酸酶、血浆MCP-1的变化

目的探讨大鼠腹主动脉球囊扩张术后内膜增生、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)信号通路以及炎症水平的变化。方法雄性SD大鼠48只,随机分为假手术组24只和球囊组24只。球囊损伤术后30天取材,血管组织作HE染色,光学显微镜观察病理学改变,免疫组织化学检测钙调神经磷酸酶在血管壁中的表达;ELISA法测定血清单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)水平。结果球囊损伤后血管壁出现新生内膜,形成的新生内膜厚度不均。球囊组与假手术组相比较内膜增生、内膜/中膜厚度明显增加(P<0.05)。免疫组织化学检测血管壁上钙调神经磷酸酶表达,球囊组与假手术组相比表达明显增加(P<0.05)。血浆炎症因子血清单核细胞趋化蛋白1水平球囊组与假手术组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论球囊扩张术导致大鼠腹主动脉内膜增生,同时伴随钙调神经磷酸酶蛋白表达明显增强以及血浆的炎症因子血清单核细胞趋化蛋白1水平升高,提示钙调神经磷酸酶信号通路和炎症因子血清单核细胞趋化蛋白1可能在球囊损伤后内膜增生过程中起重要作用。

川崎病患儿血清CaN、NFATc1水平与免疫球蛋白治疗反应的相关性

目的探讨川崎病患儿血清钙调神经磷酸酶(CaN)、活化T细胞核因子c1(NFATc1)水平与免疫球蛋白(IVIG)治疗反应的相关性,以期为临床改善治疗效果提供理论参考。方法采用前瞻性研究,选取平顶山市第一人民医院2018年1月至2023年1月100例川崎病患儿作为研究对象,检测入院时患儿的血清CaN、NFATc1水平,同时收集患儿的一般资料,根据IVIG治疗反应情况分为IVIG治疗敏感组与IVIG治疗无反应组。比较两组患儿的血清CaN、NFATc1水平及一般资料,采用点二列相关性检验血清CaN、NFATc1水平与IVIG治疗反应之间的关系,并采用logistic回归性检验二者对IVIG治疗反应的影响。结果100例患儿中有20例为IVIG治疗无反应,占比为20%(20/100)。IVIG治疗无反应组患儿入院时血清CaN、NFATc1及C反应蛋白(CRP)水平高于IVIG治疗敏感组(P<0.05)。经点二列相关性检验显示血清CaN、NFATc1水平与川崎病患儿IVIG治疗无反应存在正相关关系(r>0,P<0.05)。经logistic回归性分析检验显示高水平血清CaN、血清NFATc1是导致患儿IVIG治疗无反应的影响因素(P<0.05)。结论川崎病患儿IVIG治疗无反应发生风险较高,且与血清CaN、血清NFATc1存在关系,二者的高水平表达是导致IVIG治疗无反应的影响因素。

miR-494-3p靶向调控RCAN1对高糖诱导的足细胞损伤的影响

目的 探讨miR-494-3p对高糖(HG)诱导的小鼠肾足细胞(MPC5)损伤的影响及其对钙调磷酸酶调节蛋白1 (RCAN1)的调控作用。方法 HG诱导MPC5细胞建立细胞损伤模型,随机分为NC组、HG组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-494-3p组、HG+pcDNA组、HG+RCAN1组、HG+anti-miR-494-3p+si-NC组、HG+anti-miR-494-3p+si-RCAN1组。采用实时PCR (qRT-PCR)检测miR-494-3p、RCAN1 mRNA表达量;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平;双荧光素酶报告实验检测miR-494-3p mimic对Wt-RCAN1荧光素酶活性的影响;Western blotting检测RCAN1蛋白表达量。结果与NC组比较,HG组miR-494-3p表达量升高,凋亡率、IL-1β、TNF-α水平升高,RCAN1 mRNA及蛋白水平降低(P <0.05);与HG+anti-miR-NC组比较,HG+anti-miR-494-3p组凋亡率、IL-1β、TNF-α水平降低(P <0.05);miR-494-3p mimic可降低Wt-RCAN1荧光素酶活性(P <0.05);与HG+pcDNA组比较,HG+RCAN1组凋亡率、IL-1β、TNF-α水平降低(P <0.05);与HG+anti-mi R-NC+si-NC组比较,HG+anti-miR-494-3p+si-RCAN1组凋亡率、IL-1β、TNF-α水平升高(P <0.05)。结论 沉默miR-494-3p可通过促进RCAN1表达抑制MPC5细胞凋亡、炎症反应,从而减轻HG诱导的MPC5细胞损伤。

EF-hand对钙调磷酸酶B同源蛋白2的生物学功能影响

目的探讨EF-hand结构对钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物学功能的影响。方法通过PCR扩增CHP2 cDNA片段,构建带GFP标签的野生型及EF-hand突变型CHP2表达质粒;与钠氢离子交换蛋白1(NHE1)共转染PS120细胞;采用激光共聚焦显微镜、膜滤过法、免疫共沉淀等手段,明确CHP2结合Ca2+的数量、部位,以及对CHP2与NHE1结合的影响;在血清饥饿条件下,观察表达EF-hand突变的CHP2(NHE1/CHP2-EF3m/4m)对细胞生存的影响。结果分别突变EF-hand结构EF3或EF4,CHP2结合Ca2+减少;同时突变EF3和EF4,CHP2不能结合Ca2+;免疫共沉淀实验结果显示乙二胺四乙酸(EDTA)剥夺CHP2携带的Ca2+之后,CHP2与NHE1结合的数量明显减少;不携带Ca2+的CHP2在细胞内与NHE1结合的数量也明显减少;在血清饥饿条件下,表达不携带Ca2+的CHP2的细胞存活数量减少。结论 CHP2能结合2个Ca2+,结合部位在EF3和EF4;携带Ca2+能增强CHP2与NHE1的结合能力;在血清饥饿条件下,携带Ca2+的CHP2能提升细胞抵抗死亡的能力。

缬沙坦对压力负荷心肌肥大钙调神经磷酸酶(CaN)通路的作用

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体(AngⅡ,AT1及AT2)拮抗剂对致心肌肥厚的钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路的影响。方法腹主动脉缩窄法建立大鼠压力负荷模型,实验动物分为手术组(n=8);缬沙坦组(n=8):手术组+缬沙坦(1mg/kg·d);PD123319(AT2R受体拮抗剂)组(n=8):手术组+PD123319(30mg/kg·d);假手术组(n=8)。放射免疫法检测血浆、心肌AngⅡ浓度,免疫沉淀法检测心肌钙蛋白酶(ucalpain,mcalpain)及CaN蛋白表达及其磷酸化。结果缬沙坦组血浆AngⅡ浓度显著高于假手术组及PD123319组(P<0.05),缬沙坦组心肌AngⅡ浓度则低于假手术照组及PD123319组(P<0.05)。手术组ucalpain蛋白表达显著高于假手术组(P<0.01),缬沙坦组显著低于手术组及PD123319组(P<0.05),手术组与PD123319组间差异没有显著性(P>0.05)。手术组CaN磷酸化显著高于假手术组(P<0.01),缬沙坦组显著低于手术组及PD123319组(P<0.05),手术组与PD123319组间差异没有显著性(P>0.05)。结论ucalpain参与激活高压力负荷下心肌组织CaN通路,ucalpain的上调通过AT1起作用,AT1受体拮抗剂的心脏保护作用与其抑制了m-calpain有关。

RCAN1在心血管病中的作用机制

钙调神经磷酸酶调节因子1(regulator of calcineurin 1,RCAN1)基因在人类21号染色体唐氏综合征关键区域被首次发现,主要在有颌脊椎动物表达,在无脊椎动物和真菌中也有少量表达。RCAN1在大脑、心、骨骼肌、肾和肠道等多种组织中差异表达,在活性氧、Ca^(2+)、淀粉样蛋白β和激素等因素作用下持续表达。RCAN1与Ca^(2+)依赖的钙调磷酸酶(calcineurin,CN)结合抑制CN活性,调节重要底物的去磷酸化,参与线粒体稳态、昼夜节律、肥胖及产热等功能调节,在肿瘤、脑血管疾病、糖尿病等多种疾病中发挥了重要作用。近年来发现,RCAN1在心肌梗死、动脉粥样硬化、心脏瓣膜的形成等多方面发挥重要作用,可能是心血管疾病治疗的潜在靶点。

RCAN1及CnA在下肢闭塞性动脉硬化支架术后再狭窄组织中的表达及意义

目的·观察钙调神经磷酸酶调节因子1(RCAN1)、钙调神经磷酸酶A(Cn A)在下肢闭塞性动脉硬化介入术后支架内再狭窄组织中的表达,探讨其与支架内再狭窄的相关性。方法·收集2013年9月至2016年6月重庆医科大学附属第一医院血管外科中心下肢闭塞性动脉硬化股浅动脉支架内再狭窄血管标本15例,取支架狭窄段、支架近端、支架远端血管组织,采用H-E及Masson染色观察组织形态学变化;Western blotting检测RCAN1、Cn A、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;免疫组化及免疫荧光检测RCAN1、Cn A蛋白的表达及分布;免疫共沉淀检测RCAN1蛋白和Cn A蛋白的相互作用。结果·RCAN1在支架远端组织的表达水平显著高于在支架近端组织和支架狭窄段组织的表达水平(P<0.05),RCAN1在支架近端组织的表达水平显著高于在支架狭窄段组织的表达水平(P<0.05);Cn A和PCNA在支架狭窄段组织的表达水平显著高于在支架近端组织、支架远端组织的表达水平(P<0.05);免疫组化及免疫荧光染色结果显示RCAN1和Cn A主要在血管平滑肌细胞质中表达;免疫共沉淀结果显示RCAN1与Cn A在血管组织中存在相互作用。结论·RCAN1的低水平表达与Cn A的表达水平增高可能与支架内再狭窄发生有关。

CD137-CD137L信号通过CaM-CaN通路调控小鼠血管平滑肌细胞NFATc1表达

目的:探讨CD137-CD137L信号是否通过钙调蛋白-钙调神经磷酸酶(Calmodlin-Calcineurin,CaM-CaN)通路调控小鼠血管平滑肌细胞活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)的表达。方法:采用改良组织贴块法原代培养小鼠血管平滑肌细胞。实验分两部分,第一部分细胞分组:对照组、CD137刺激组(激动型CD137抗体10μg/m L)和CD137抑制组(抑制型CD137抗体10μg/m L预孵30 min后+激动型CD137抗体10μg/m L);第2部分细胞分组:对照组、CD137刺激组(激动型CD137抗体10μg/m L)、si CaM组(si-CaM+CD137刺激组)和si CaN组(si-CaN+CD137刺激组)。分别采用蛋白质印迹和RT-PCR检测平滑肌细胞CaM、CaN及NFATc1的蛋白和mRNA表达水平。结果:(1)蛋白质印迹和RT-PCR结果显示,与对照组相比,CD137刺激组小鼠平滑肌细胞CaM、CaN及NFATc1表达明显升高(P<0.05);与CD137刺激组相比,CD137抑制组CaM、CaN及NFATc1表达显著降低(P<0.05)。(2)通过si-RNA技术分别沉默CaM和CaN后,与CD137刺激组相比,si CaM组CaM、CaN及NFATc1表达水平明显降低(P<0.05);si CaN组的CaM无明显改变(P>0.05),而CaN及NFATc1表达明显降低(P<0.05)。结论:CD137-CD137L信号可能通过CaM-CaN通路调控NFATc1的表达。

异钩藤碱通过下调CaN、ERK2和上调MKP-1的表达抑制大鼠心肌细胞肥大

目的研究异钩藤碱抑制大鼠心肌细胞肥大的作用并探讨其可能的作用机制。方法采用乳SD大鼠原代心肌细胞培养法,建立心肌细胞肥大模型;HE染色观察细胞形态学变化,采用图像分析系统测量心肌细胞的表面积、BCA法测定细胞蛋白质含量,确定药物抑制心肌细胞肥大的作用;实时荧光定量PCR检测细胞中CaN及ERK2 mRNA的表达、Western blotting检测细胞中MKP-1蛋白的表达,探讨药物作用的可能机制。结果异钩藤碱1μmol/L、10μmol/L明显抑制AngⅡ诱导心肌细胞表面积和蛋白含量的增加,改善心肌细胞形态学;明显抑制AngⅡ所致CaN、ERK2 mRNA表达的增加,而各浓度组则显著升高MKP-1蛋白的表达。结论异钩藤碱具有抑制大鼠心肌细胞肥大的作用,其机制可能与抑制AngⅡ所致CaN、ERK2 mRNA表达和升高MKP-1蛋白的表达有关。

rcan1-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcan1-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究rcan1-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.

MYOZ2通过负调控TCAP的表达促进C3H10T1/2细胞成脂分化

本研究旨在明确钙调磷酸酶肌小节结合蛋白2(myozenin2,MYOZ2)的组织表达特性,阐明其对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响及可能的作用机制。采集180日龄马身猪、60日龄ICR小鼠、35日龄罗斯肉鸡和12月龄小尾寒羊背最长肌、皮下脂肪和肝组织,检测MYOZ2基因mRNA表达。结果显示,MYOZ2基因在所检测的物种中表现出相似的组织表达规律,在背最长肌表达量最高,皮下脂肪与肝组织低水平表达。在C3H10T1/2细胞中沉默MYOZ2基因后,qRT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂关键基因PPARγ、FABP4表达极显著下调(P<0.01);Western印迹结果表明,PPARγ蛋白含量显著降低(P<0.05);油红O染色发现,沉默MYOZ2基因后脂滴数明显减少,甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。利用qRT-PCR技术检测沉默MYOZ2基因后,脂肪代谢相关基因SCD、FASN、SREBP1、NR1H3、DGAT1、PNPLA2、HSL、CES1、CPT1等的表达,结果显示,SCD、FASN、SREBP1、PNPLA2、HSL极显著下调(P<0.01),NR1H3显著下调(P<0.05),DGAT1表达下调但差异不显著,CES1、CPT1显著上调(P<0.05)。利用STRING数据库构建MYOZ2相关蛋白质互作网络图,发现MYOZ2可能通过肌联蛋白帽(Titin-cap,TCAP)与PPARγ相互作用进而影响成脂分化。沉默TCAP基因,qRT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂关键基因PPARγ、FABP4表达极显著上调(P<0.01);Western印迹结果表明,与对照组相比,PPARγ蛋白含量显著升高(P<0.05);油红O染色发现,沉默TCAP基因后脂滴数明显增多,甘油三酯含量显著升高(P<0.05)。利用qRT-PCR技术检测沉默MYOZ2后TCAP基因的表达结果显示,沉默MYOZ2后TCAP的表达极显著升高(P<0.01)。综上所述,MYOZ2基因在背最长肌中表达量最高,在皮下脂肪和肝组织中也有少量表达。此外,MYOZ2可能通过MYOZ2-TCAP-PPARγ途径影响成脂关键基因PPARγ和FABP4的表达,进而调控脂肪酸代谢相关基因SCD、FASN、SREBP1、NR1H3、DGAT1、PNPLA2、HSL、CES1、CPT1,在成脂分化过程中发挥重要作用。

RCAN1/CaNA在颞叶癫痫患者及戊四氮动物模型中的表达变化

目的观察钙调神经磷酸酶调节因子1(RCAN1)及钙调神经磷酸酶A(CaNA)在颞叶癫痫患者及戊四氮(PTZ)致癫动物模型中的表达变化。方法收集颞叶癫痫患者手术切除的皮质,并纳入癫痫组(n=18);收集脑外伤患者手术切除的皮质,并纳入对照组(n=11)。30只SD大鼠随机分为模型对照组(MC)和PTZ组。分别应用Western blot和免疫组织化学染色检测RCAN1和CaNA的表达情况;应用免疫荧光染色对RCAN1进行定位;应用免疫共沉淀分析RCAN1与CaNA的相互作用。结果 RCAN1定位于神经元的细胞膜;在颞叶癫痫患者及癫痫模型中,RCAN1的表达水平较对照组明显下降(P<0.01),CaNA的表达水平较对照组明显增高(P<0.01);RCAN1与CaNA具有相互作用。结论在颞叶癫痫患者及癫痫模型中,RCAN1低表达,而CaNA高表达,提示RCAN1可能通过调控CaNA参与癫痫的形成。

钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅡδRNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响

目的研究钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ(Ca2+/Calmodulin dependent kinaseⅡδ,Ca MKⅡδ)RNA干扰对下游基因表达及破骨细胞分化的影响,以证实其在破骨细胞分化中的作用。方法应用慢病毒构建Ca MKⅡδRNA干扰载体,并确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值及转染效率。小鼠RAW264.7细胞分为对照组、空白载体组和干扰组。转染5 d后收获细胞,确定干扰效率;并检测RNA干扰对活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、非受体酪氨酸激酶(c-Src)基因表达及破骨细胞分化的影响。结果成功构建了Ca MKⅡδRNA干扰载体,最佳转染MOI值为30,转染效率可达78%(P<0.05)。重组病毒对Ca MKⅡδ的干扰效率在mRNA水平超过78%,在蛋白水平超过70%(P<0.01)。Ca MKⅡδRNA干扰显著降低NFATc1、TRAP和c-Src基因,与对照组、空白载体组比较,其mRNA水平下降分别超过了47.8%、43.3%和48.5%(P<0.05,P<0.01),蛋白相对水平分别超过了61.1%、48.2%和39.6%%(P<0.01);免疫荧光细胞化学检测也得到相似结果。Ca MKⅡδRNA干扰也显著降低了破骨细胞生成及骨吸收功能;与其他两组比较,干扰组破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数目和面积下降分别超过了49.8%、47.6%和61.3%(P<0.01)。结论 Ca MKⅡδRNA干扰可显著下调其下游NFATc1、TRAP、c-Src基因表达并抑制破骨细胞分化;Ca MKⅡδ在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用。

CREB和ERK1/2在CaMKⅡδ调控破骨细胞分化中的作用

目的探索c AMP反应原件结合蛋白(CREB)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)δ调控破骨细胞分化中的作用及分子机制。方法构建Ca MKⅡδR NA干扰载体并转染小鼠R AW264.7细胞,确定其干扰效率。病毒转染细胞后,用50ng/ml核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导,于不同时间点检测CREB、ERK1/2蛋白磷酸化水平。应用ERK1/2信号阻断剂PD98059处理细胞,检测ERK1/2信号阻断对活化T细胞核因子c1(NFATc1)基因表达及破骨细胞分化的影响。结果 Ca MKⅡδ干扰载体在m RNA和蛋白水平的干扰效率分别为77.2%和70.2%。Ca MKⅡδ干扰可明显降低CREB、ERK1/2蛋白磷酸化水平,下调幅度分别为21%~55%和55%~64%。此外,ERK1/2信号阻断明显下调了NFATc1蛋白表达,使破骨细胞数目、骨吸收陷窝数目及面积分别下降了39.3%、50.0%和52.3%。结论 Ca MKⅡδRNA干扰可明显抑制CREB和ERK1/2蛋白磷酸化;CREB和ERK1/2参与了Ca MKⅡδ对破骨细胞分化的调控。