新型钙调神经磷酸酶抑制药伏环孢素临床研究进展

伏环孢素是一种口服新型钙调神经磷酸酶抑制药,是环孢素A的衍生物,主要用于治疗自身免疫性疾病,如银屑病、非感染性葡萄膜炎和器官移植后排斥反应。2021年1月,基于两个Ⅱ期和Ⅲ期临床试验的积极结果,FDA批准伏环孢素与标准治疗方案联合用于治疗成人活动性狼疮肾炎。目前,也有研究在探索伏环孢素用于新型冠状病毒感染的肾移植患者。本文对伏环孢素的作用机制、药动学和药效学、用法用量、联合用药和疾病中应用进行归纳总结,为其临床用药提供参考。

类钙调磷酸酶B亚基蛋白GhCBL3-A01调控棉花黄萎病抗性的功能分析

【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcium B-like protein,CBL)基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能,为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得GhCBL3-A01基因的同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)和H2O2处理的棉株中GhCBL3-A01基因的表达量变化。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术研究GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病中的功能。通过检测活性氧积累以及相关基因的表达量,初步分析GhCBL3-A01的作用机制。【结果】陆地棉中GhCBL3-A01及其3个同源蛋白均含有3个CBL家族典型的EF-hand结构域。大丽轮枝菌、MeJA和H2O2处理后,GhCBL3-A01的表达量显著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01导致病株率和病情指数显著降低,茎秆维管束褐变程度减轻,有病菌繁殖的茎段数量明显减少,增强了棉株对黄萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中活性氧积累增多,防御相关基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信号通路关键基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量增加。【结论】GhCBL3-A01通过调控防御相关基因、茉莉酸信号通路基因的表达和活性氧积累负调控棉花对黄萎病的抗性,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。

钙调神经磷酸酶在L-精氨酸抗心肌肥厚中的作用

目的研究L-精氨酸抗右心室心肌肥厚作用及其与钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)信号通路的关系。方法利用野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导大鼠右心室心肌肥厚模型和前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)诱导心肌细胞肥大模型,分别以右心室肥厚指数(right ventricle hypertro-phy index,RVHI,即右心室/左心室+室间隔)、心肌细胞直径、蛋白含量和心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)mRNA表达为心肌肥厚指标。用RT-PCR法检测mRNA的表达;Western blot法检测蛋白表达;荧光法检测细胞内钙[Ca2+]i的变化情况。结果L-精氨酸200mg.kg-1.d-1预防和治疗给药均明显抑制MCT诱导的大鼠心肌肥厚,降低MCT所致心肌CaN mRNA和蛋白及其下游因子NFAT3及GATA4蛋白表达的增加。L-精氨酸1mmol.L-1也明显抑制PGF2α100nmol.L-1诱导的大鼠心肌细胞肥大和[Ca2+]i升高,阻遏其诱导的CaN mRNA及CaN-,NFAT3-,GATA4-蛋白表达升高。在体和离体实验中一氧化氮合成酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸-甲酯均可完全阻断L-精氨酸的作用。结论L-精氨酸可能通过降低[Ca2+]i,从而抑制CaN信号转导通路而产生抗右心室心肌肥厚作用。

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。

钙调神经磷酸酶抑制剂在性器官部位白癜风中的临床疗效及对TNF-α的影响

目的:观察钙调神经磷酸酶抑制剂在性器官部位白癜风患者的临床效果及对机体TNF-α水平的影响。方法:选取2013年8月至2016年8月医院诊治的性器官部位白癜风患者100例,采用随机数字方法分为对照组(n=50)和观察组(n=50)。对照组采用窄谱中波紫外线照射治疗,观察组联合钙调神经磷酸酶抑制剂治疗,采用平衡法利用r技术其对TNF-α水平进行测定,比较两组临床疗效及对TNF-α水平的影响。结果:两组治疗前皮损面积、色素积分差异无统计学意义(P>0.05);观察组治疗后皮损面积、色素积分、首次复色累及照射剂量、治疗次数少于对照组(P<0.05)。观察组治疗后TNF-α水平,显著低于对照组(P<0.05)。观察组治疗后不良反应发生率为6.0%,显著低于对照组的12.0%(P<0.05)。结论:与窄谱中波紫外线照射治疗相比,性器官部位白癜风患者利用钙调神经磷酸酶抑制剂治疗能降低TNF-α水平,值得推广应用。

生物信息学方法筛选华支睾吸虫成虫功能基因——钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白

目的本文通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库,筛选其功能基因。方法应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库,进行大量EST测序,然后应用生物信息学方法将EST序列与GenBank中登陆的序列进行同源性比对、序列拼接及基因完整性判断;并应用NCBI上的RPSBLAST对所筛选基因的保守域进行搜索比对,利用PredictProtein分析、预测其功能域及二级结构。结果从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选的钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白(CsCBLP)基因,经同源性分析,CsCBLP与褐家鼠钙调神经磷酸酶(CaN)同源性为53%,与尾刺耐格里原虫CaNB同源性为40%,与新小杆线虫属结合蛋白的同源性为51%;保守域的比对及功能域、二级结构的预测显示所筛选的CsCBLP是钙调神经磷酸酶B亚基的的类似物,属于钙结合蛋白家族。结论应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因。

球囊扩张术后大鼠腹主动脉钙调神经磷酸酶、血浆MCP-1的变化

目的探讨大鼠腹主动脉球囊扩张术后内膜增生、钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)信号通路以及炎症水平的变化。方法雄性SD大鼠48只,随机分为假手术组24只和球囊组24只。球囊损伤术后30天取材,血管组织作HE染色,光学显微镜观察病理学改变,免疫组织化学检测钙调神经磷酸酶在血管壁中的表达;ELISA法测定血清单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)水平。结果球囊损伤后血管壁出现新生内膜,形成的新生内膜厚度不均。球囊组与假手术组相比较内膜增生、内膜/中膜厚度明显增加(P<0.05)。免疫组织化学检测血管壁上钙调神经磷酸酶表达,球囊组与假手术组相比表达明显增加(P<0.05)。血浆炎症因子血清单核细胞趋化蛋白1水平球囊组与假手术组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论球囊扩张术导致大鼠腹主动脉内膜增生,同时伴随钙调神经磷酸酶蛋白表达明显增强以及血浆的炎症因子血清单核细胞趋化蛋白1水平升高,提示钙调神经磷酸酶信号通路和炎症因子血清单核细胞趋化蛋白1可能在球囊损伤后内膜增生过程中起重要作用。

HPLC和MALDI-TOF-MS法分析重组人钙调磷酸酶B亚基的纯度和肽图谱

用反相高效液相色谱 (RP HPLC)法对重组人钙调磷酸酶B亚基 (rhCNB)的纯度和肽图谱进行了测定 ,以比较不同批次产品的纯度及其一级结构的一致性 ,对其进行质量控制 .并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)法进行验证 .结果表明 ,运用梯度洗脱RP HPLC法能对样品进行纯度检查和肽图谱分析 ,测得 3批样品纯度均达到 98%以上 ,肽图谱能达到批间一致 .同时用MALDI TOF MS法测定 ,纯度结果二者相符 ,质谱肽图经计算机辅助分析 ,确证rhCNB一级结构与天然CNB一致 .证明该方法灵敏、准确、可靠 .

钙调神经磷酸酶-T细胞核因子信号通路在应力诱导成肌细胞凋亡中的作用

目的探讨钙调神经磷酸酶(CaN)-T细胞核因子(NFAT)信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用。方法构建成肌细胞体外培养—力学刺激模型,利用多通道应力加载系统对细胞加载不同时间的周期性张应力,加入CaN的特异性抑制剂环孢素(CsA)作为对比。采用Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测成肌细胞凋亡情况,实时聚合酶链式反应检测CaN和NFAT mRNA的表达情况,蛋白质印迹法检测NFAT3的蛋白含量。结果随加力时间的延长,细胞凋亡逐渐增加,CaN亚基CnA、CnB及NFAT3的mRNA表达及NFAT3蛋白含量逐渐升高;加入CsA后,细胞凋亡减少,CnA、NFAT3的mRNA表达及NFAT3的蛋白含量明显减少。结论周期性张应力可以诱导成肌细胞发生凋亡;CaN-NFAT信号通路可能参与了周期性张应力诱导的成肌细胞凋亡。

钙调神经磷酸酶B亚基的^(125)I标记及其血脑屏障的通透性

钙调神经磷酸酶与老年性痴呆密切相关 ,为了解其 B亚基的血脑屏障的通透性 ,采用 Iodogen法对钙调神经磷酸酶 B亚基 (CNB)进行 12 5I标记 ,标记率高达 85 % ,产物 12 5I- CNB比活度为 74 0 GBq· g-1,放化纯度为 95 .7%。小鼠静脉注射 12 5I- CNB结果显示血脑屏障能够阻止完整的 CNB进入脑 。

肾性高血压大鼠心肌Na^+-K^+-ATP酶和钙调神经磷酸酶mRNA表达及厄贝沙坦的干预作用

目的观察肾性高血压大鼠(RHR)左心室肌组织Na+-K+-ATP和钙调神经磷酸酶(CaN)mRNA的表达及其活性以及厄贝沙坦干预。方法采用两肾一夹制造肾性高血压模型,造模成功大鼠随机分为模型组和厄贝沙坦组(50 mg.kg-1.d-1),每组7只;另设假手术组大鼠7只;测量各组大鼠术前、术后血压,用药8 w后,测量大鼠左心室质量指数(LVM I),采用实时荧光定量PCR技术检测左心室肌组织(LV)Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA、CaN mRNA及心钠素(ANP)mRNA表达,生化酶学方法检测心肌Na+-K+-ATP酶、CaN活性。结果与假手术组比较,RHR血压、LVM I及心肌ANP mRNA表达明显增加,心肌Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA表达及其活性明显降低,CaN mRNA表达及其活性升高;与RHR模型组比较,厄贝沙坦能降低RHR血压、LVM I及心肌ANP mRNA表达,上调Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA表达(P<0.05)并增加其活性,降低CaN mRNA表达(P<0.05)及CaN活性。结论 RHR左心室肥厚发生及逆转与心肌Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA、CaN mRNA的表达及其活性改变有关,心肌Na+-K+-ATP酶、CaN活性改变可能与其在mRNA表达水平改变部分相关。

钙调神经磷酸酶对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及海马区基质金属蛋白酶-9的影响

目的探讨钙调神经磷酸酶对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及海马区基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的影响。方法采用Aβ_(1-42)海马注射建立AD模型,以他克莫司(FK506)干预。用Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力,RT-PCR、免疫组化以及明胶酶谱技术检测海马区MMP-9的表达。结果与对照组相比,AD模型组大鼠学习记忆能力明显减退(P<0.01),MMP-9基因转录、蛋白表达和酶活性均明显增加(P<0.05)。FK506干预后,AD大鼠学习记忆能力明显改善,其海马区MMP-9基因转录减少、酶活性降低(P<0.05)。结论抑制CaN激活可改善AD症状,可能与影响MMP-9的表达有关。

基于对miR-133的调控探讨丹参酮ⅡA影响钙调神经磷酸酶介导的心肌肥厚的作用机制

目的探讨丹参酮ⅡA是否可通过mi R-133影响钙调神经磷酸酶途径来改善胸主动脉缩窄法(TAC)诱导大鼠的心肌肥厚。方法 60只SD大鼠随机分为3组:假手术组、手术组和丹参酮ⅡA治疗组。检测各组超声和心室体质量比、mi R-133、调节性钙调神经磷酸酶作用蛋白1(MCIP1)、钙调神经磷酸酶(Calcineurin)的表达及32P的释放情况(P-release)。结果 1)除射血分数(EF)外,手术组的指标均与其余两组有差异,丹参酮ⅡA组的心肌肥厚有显著的改善;2)手术组的MCIP1和mi R-133水平均与其余两组比较均有显著性差异(P<0.05),丹参酮ⅡA组MCIP1水平明显高于假手术组(P<0.05),mi R-133水平低于假手术组(P<0.05);3)手术组的Calcineurin的蛋白水平显著高于其余两组(P<0.01),丹参酮ⅡA组与假手术组比较无明显差异;4)手术组的32P释放均高于其余两组(P<0.01),丹参酮ⅡA组32P释放高于假手术组(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA可以有效的逆转手术组诱导的大鼠心肌肥厚,其机制与调控mi R-133进而降低Calcineurin相关。

活动性狼疮肾炎患者外周血单个核细胞钙调神经磷酸酶活性的检测及白细胞介素-4表达变化

目的:检测活动性狼疮肾炎(LN)患者外周血单个核细胞(PBMC)白细胞介素-4(IL-4)表达及其与钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)活性的关系。方法:体外培养活动性LN患者PBMC,应用发色底物法检测胞浆CaN活性,逆转录PCR检测IL-4 mRNA表达。结果:(1)在单纯培养情况下,正常对照组和LN组PBMC均出现一定量CaN活化,活动性LN组显著高于正常对照组[(46.08±5.58)mmol/mg.pr vs(8.81±3.61)mmol/mg.pr,P<0.01];在PMA+Ionomycin刺激下,各组CaN活性均升高,活动性LN组CaN活性明显高于正常对照组[(69.34±12.59)mmol/mg.pr vs(37.12±11.57)mmol/mg.pr,P<0.01];(2)LN患者PBMC在单纯培养和PMA+Ionomycin刺激时IL-4蛋白和mRNA表达均显著高于相应的对照组(P<0.05);(3)在单纯培养和PMA+Ionomycin刺激时,FK506对LN PBMC表达IL-4蛋白和mRNA均有显著抑制作用(P<0.01)。结论:LN患者PBMC存在CaN过度活化;LN患者PBMC高效表达IL-4与其CaN过度活化密切相关,通过阻断CaN活性可调控IL-4表达。

钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路与系统性红斑狼疮关系的研究进展

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以多种自身抗体产生为特点的侵犯多系统多脏器的自身免疫性疾病,其发病机制尚未明确,目前认为T淋巴细胞异常是SLE的发病的关键。钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子(Calcineurin-nuclear factors of activatedT cells,CaN-NFAT)信号通路作为T细胞内重要的生物信号转导通路,在T细胞活化中起到调节枢纽的作用,本文就CaN/NFAT信号途径在SLE中的作用及目前相关主要治疗药物的研究现状作一综述,为SLE的基础研究及临床治疗提供依据。

钙离子对钙调神经磷酸酶B亚基结构和功能的影响

应用原紫外CD光谱、内源荧光光谱以及ANS荧光光谱探究了Ca^(2+)对钙调神经磷酸酶(CN)调节亚基(CNB)结构和功能的影响.结果显示:Ca^(2+)能够激活CN磷酸酶活性提高到约1.5倍;CD谱显示结合Ca^(2+)后CNB出现α-螺旋含量上升、无卷曲含量下降、分子有序性升高等现象;!源荧光光谱显示结合Ca^(2+)导致CNB结构更加紧凑;ANS荧光光谱显示Ca^(2+)结合导致其疏水性增强.结合Ca^(2+)后,CNB分子有序性升高,结构更加紧凑,疏水表面暴露.这些结构变化促进了其与CNA的结合并激活了CNA的磷酸酶活性.

钙调神经磷酸酶及其二亚基免疫性质和功能的研究

钙调神经磷酸酶(Calcineurin, CaN)是目前所知唯一活性受钙、钙调素调控的磷蛋白磷酸酶。其含量占脑内蛋白总量的1％,必定有其重要的生理意义,但至今为止,它的生理功能仍很不清楚。本文试图用免疫学方法,对CaN的生理功能进行初步探索。

CD和FT-IR法分析重组人钙调磷酸酶B亚基冻干前后与多批产品二级结构的一致性

目的通过测定重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的圆二色谱(CD)和傅立叶变换红外光谱(FT-IR),来研究rhCNB冻干前、后和rhCNB多批产品之间二级结构的一致性,从而确定生产工艺是否稳定,样品是否发生变性等,达到控制产品质量的目的。方法采用CD和FT-IR光谱法分别对3批rhCNB进行蛋白质二级结构测定,并对rhCNB冻干前与冻干后样品进行了CD和FT-IR光谱法二级结构测定。结果与结论CD和FT-IR光谱测得3批样品谱图均达到批间一致,说明样品二级结构稳定,工艺过程较稳定,产品未发生变性。rhCNB冻干前与冻干后2种图谱均无明显变化,说明冻干工艺对rhCNB的二级结构并无改变。

IGF-1介导的钙调神经磷酸酶信号通路在心肌肥厚中的作用及人参皂苷Rb1的干预效应

目的通过建立大鼠心肌肥厚模型观察人参皂苷Rb1对胰岛素样生长因子-1（IGF-1）介导的心肌肥厚的影响。方法采用手术缩窄腹主动脉的方法建立大鼠心肌肥厚模型。40只大鼠随机分为手术组（模型组、Rb1组、缬沙坦组，每组10只）及假手术组（10只）。4组大鼠分别给予相应处理，常规饲养6周后：测定颈动脉收缩压，计算左心室肥厚指数（LVMI），ELISA法测定大鼠血清IGF-1水平，Masson染色观察心肌组织变化，Westernblot法测定大鼠心肌组织钙调神经磷酸酶（CaN）的含量。结果与假手术组比较，手术组大鼠的颈动脉收缩压、LVMI、IGF-1及CaN均明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；与模型组比较，Rb1组的颈动脉收缩压、LVMI、IGF-1及CaN均明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论人参皂苷Rb1能有效抑制大鼠的心肌肥厚，其作用可能与降低IGF-1及其下游通路CaN的表达有关。

钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究

目的:基于小动物活体成像检测技术,探讨重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(rhCNB)的肝癌靶向性。方法:采用肿瘤组织块法建立BALB/c裸小鼠荷人肝癌细胞SMMC-7721原位肝癌模型。原位肝癌模型建立第14天时,按荷瘤动物体重大小随机分为FITC标记的rhCNB(rhCNB-FITC)给药组和FITC对照组,每组12只,各取6只分别用于给药后2 h、24 h剖解取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏用小动物活体成像系统进行荧光检测。另取未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠随机分为rhCNB-FITC给药组和空白对照组,rhCNB-FITC给药组12只,各取6只分别用于给药后2 h、24 h剖解取相同的脏器进行荧光检测。空白对照组6只,剖解取出相同的脏器进行荧光检测。结果:rhCNB-FITC给予未接种肿瘤的正常动物2 h时,主要分布于动物的肾脏、肝、胃、心和肺,脾脏未见明显分布;24 h时,主要分布于动物的肾脏,肝、胃、心、肺和脾脏未见明显分布。在原位肝癌模型试验中,rhCNB-FITC给药2 h时,主要分布于肝肿瘤、肾脏、肺、胃和心脏等组织器官,脾脏内未检测到明显荧光;FITC给药组只有在肝和胃组织中能检测到荧光,而且荧光强度明显弱于rhCNB-FITC给药组;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部(包括正常组织和肝肿瘤组织)的荧光强度比较,P<0.01,具有显著统计学意义。rhCNB-FITC给药24 h时,主要聚集在肝肿瘤、胃、肾脏和肺等组织器官,其中rhCNB在肝肿瘤部位的浓度最高;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝肿瘤部的荧光强度比较,P<0.05,具有统计学意义。结论:重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基具有良好的肝癌靶向性。