亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆和生物信息学分析

目的从亚洲带绦虫（Taenia asiatica）成虫cDNA文库中克隆亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因（calci—neurinB），并分析和预测其编码蛋白的结构和功能。方法构建亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库，从文库中识别钙调神经磷酸酶B基因并进行生物信息学分析和登录。结果该基因登录号为ABN14963．1，是全长基因，长度747bp，编码区为56～563，编码169个氨基酸；无跨膜区，蛋白的理化性质稳定；含有4个“EF—hand”Ca^2＋结合区域；与Gen—Bank中日本血吸虫同源基因的一致性达90％，相似性达95％；预测3个主要的抗原表位99～104、20～25、23～28在钙调神经磷酸酶B蛋白空间结构的分子表面。结论应用生物信息学方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出一个钙调神经磷酸酶B基因。

亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因的原核表达和免疫学分析

【目的】对亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因(CaN)进行克隆、表达和免疫学初步研究。【方法】将亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。【结果】PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-30a(+)-Ta CaN构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因能在大肠杆菌BL-21/DE3中表达,经亲和层析得到了纯化重组蛋白。重组蛋白能被感染了亚洲牛带绦虫的猪和患者的血清识别。【结论】亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达。为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的获得和分析

目的 从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新的蛋白基因 ,为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法 构建日本血吸虫成虫cDNA文库 ,挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录。结果 获得了 1个日本血吸虫新基因 -钙调神经磷酸酶 (Calcineurin ,CaN)基因B(AY2 2 0 75 1) ,长 12 6 6bp ,编码 16 9个氨基酸 ,含有 2个“EF -hand”Ca+2 结合区域 ,与曼氏血吸虫CalcineurinB有 84 %的同源性。

新型钙调神经磷酸酶抑制药伏环孢素临床研究进展

伏环孢素是一种口服新型钙调神经磷酸酶抑制药,是环孢素A的衍生物,主要用于治疗自身免疫性疾病,如银屑病、非感染性葡萄膜炎和器官移植后排斥反应。2021年1月,基于两个Ⅱ期和Ⅲ期临床试验的积极结果,FDA批准伏环孢素与标准治疗方案联合用于治疗成人活动性狼疮肾炎。目前,也有研究在探索伏环孢素用于新型冠状病毒感染的肾移植患者。本文对伏环孢素的作用机制、药动学和药效学、用法用量、联合用药和疾病中应用进行归纳总结,为其临床用药提供参考。

牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因生物信息学分析

目的从牛带绦虫(Teania saginata)成虫cDNA文库中克隆牛带绦虫钙调神经磷酸酶B(calcineurin B钙调神经磷酸酶B)基因,分析和预测其编码蛋白的结构和特性。方法构建牛带绦虫成虫cDNA质粒文库,从文库中识别钙调神经磷酸酶B基因并进行生物信息学分析。结果该基因全长510 bp,编码区为141～650,编码170个氨基酸,为全长基因。理论分子量、等电点分别为19119.3 Da和4.52;无跨膜区;三维结构建模图显示其线性表位的部位。结论应用生物信息方法从牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出钙调神经磷酸酶B基因的cDNA全长序列,并预测得到其结构与功能方面的信息。

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。

生物信息学方法筛选华支睾吸虫成虫功能基因——钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白

目的本文通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库,筛选其功能基因。方法应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库,进行大量EST测序,然后应用生物信息学方法将EST序列与GenBank中登陆的序列进行同源性比对、序列拼接及基因完整性判断;并应用NCBI上的RPSBLAST对所筛选基因的保守域进行搜索比对,利用PredictProtein分析、预测其功能域及二级结构。结果从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选的钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白(CsCBLP)基因,经同源性分析,CsCBLP与褐家鼠钙调神经磷酸酶(CaN)同源性为53%,与尾刺耐格里原虫CaNB同源性为40%,与新小杆线虫属结合蛋白的同源性为51%;保守域的比对及功能域、二级结构的预测显示所筛选的CsCBLP是钙调神经磷酸酶B亚基的的类似物,属于钙结合蛋白家族。结论应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因。

类钙调磷酸酶B亚基蛋白GhCBL3-A01调控棉花黄萎病抗性的功能分析

【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcium B-like protein,CBL)基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能,为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得GhCBL3-A01基因的同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)和H2O2处理的棉株中GhCBL3-A01基因的表达量变化。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术研究GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病中的功能。通过检测活性氧积累以及相关基因的表达量,初步分析GhCBL3-A01的作用机制。【结果】陆地棉中GhCBL3-A01及其3个同源蛋白均含有3个CBL家族典型的EF-hand结构域。大丽轮枝菌、MeJA和H2O2处理后,GhCBL3-A01的表达量显著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01导致病株率和病情指数显著降低,茎秆维管束褐变程度减轻,有病菌繁殖的茎段数量明显减少,增强了棉株对黄萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中活性氧积累增多,防御相关基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信号通路关键基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量增加。【结论】GhCBL3-A01通过调控防御相关基因、茉莉酸信号通路基因的表达和活性氧积累负调控棉花对黄萎病的抗性,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆表达及表达产物的免疫保护效果的评估

为掌握日本血吸虫钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)特性并评估其作为候选疫苗分子的潜力,采用PCR方法扩增日本血吸虫CNB基因,构建重组质粒pET-28a(+)-CNB,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用His-Bind亲和层析纯化获得重组蛋白rCNB。Western-blot结果显示,rCNB能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有较好的免疫原性。免疫组织化学分析表明,CNB主要分布在日本血吸虫虫体的睾丸、卵巢等生殖器官中,在表膜中也有少量分布。用重组蛋白rCNB结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,结果 rCNB诱导小鼠产生了27.93%(P<0.05)的减虫率和42.93%(P<0.01)的肝减卵率。结果表明,日本血吸虫CNB具有一定的免疫保护效果,为深入研究日本血吸虫钙调神经磷酸酶的生物学功能奠定了基础。

梨果黑斑病菌钙调磷酸酶基因生物信息学分析及其对侵染结构分化的调控作用

为揭示梨果黑斑病菌Alternaria alternata CaN基因的调控作用,采用RT-PCR技术克隆A.alternata CaN基因,利用在线工具对其基因及其编码蛋白进行生物信息学分析;同时分析其在A.alternata侵染结构分化过程中的表达特性;并进一步以钙调磷酸酶专一性抑制剂环孢菌素A(CsA)处理研究其对A.alternata侵染结构分化和致病性的影响。结果A.alternata克隆得到CNA和CNB基因,分别命名为AaCNA(GenBank NW_017306222)和AaCNB(GenBank NW_017306193),生物信息学分析表明AaCNA和AaCNB均无跨膜结构,且具有多个磷酸化位点,主要定位于细胞核上;AaCNA包括一个N端催化结构域、CNB结合结构域、钙调素CaM结合结构域和自抑制蛋白结构域,AaCNB具有4个EF-hand Ca 2+结合位点。qRT-PCR分析表明,在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中AaCNA和AaCNB基因表达量均显著上调,且果蜡诱导作用更明显。药理学表明,环孢菌素A处理显著抑制疏水性和蜡质诱导的A.alternata孢子萌发和附着胞形成,同时还可抑制损伤接种A.alternata早酥梨黑斑病的扩展。综上结果表明AaCNA和AaCNB参与A.alternata侵染结构形成的调控。

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究

【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白（CalcineurinB—likeprotein，CBL）基因的序列特征和表达特点，【方法】以杜梨幼苗为试材，运用同源克隆和半定量RT—PCR对PbCBLIO基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明．PbCBLIO基因编码区cDNA长度为801bp，编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4．56，估计的相对分子质量为30．45ku。其对应基因组DNA序列长1983bp，包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBLl0蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBLIO基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBLl0与番茄S1CBLIO（NP_001239045）和拟南芥AtCBLl0（NP_195026）蛋白间的同源性较高，分别为82％和77％，并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达，50～200mmol·L^（-1）CaCl2、20μmol·L^（-1）ABA、100mmol·L^（-1）NaCl、10％（w／v）PEG6000或180mmol·L^（-1）甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBLIO基因具备植物CBL基因家族的固有特征，能够响应胞内钙浓度变化，对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。

葡萄类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因VvCBL4的克隆与表达分析

【目的】在京秀(Vitis vinifera‘Jingxiu’)葡萄中克隆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因Vv CBL4及其启动子,分析Vv CBL4的表达特性与逆境胁迫的关系。【方法】用RACE技术克隆Vv CBL4的全长,实时荧光定量PCR检测Vv CBL4在不同逆境下的表达;用同源克隆技术获得Vv CBL4的启动子,在烟草叶片中瞬时表达分析Vv CBL4启动子的活性。【结果】Vv CBL4全长为959 bp,ORF为642 bp,编码213个氨基酸,具有3个EF手钙结合结构域。Vv CBL4在根部表达量最高,其次是果实。Vv CBL4的转录本能对干旱、低温和盐胁迫处理快速做出响应。Vv CBL4启动子富含与逆境响应相关的顺式作用元件。干旱、低温和盐胁迫处理能够增强启动子活性。【结论】获得Vv CBL4及其启动子序列,Vv CBL4的表达能对逆境胁迫做出响应,Vv CBL4启动子的活性受逆境胁迫诱导,说明Vv CBL4在葡萄逆境胁迫反应中具有重要的作用。

钙调神经磷酸酶在cTnI基因Asp128Tyr突变致心肌肥大中的作用

目的:探讨钙调神经磷酸酶(CaN)在心肌钙蛋白I(cTnI)基因第128位天冬氨酸→酪氨酸(Asp128Tyr)突变致心肌肥大中的作用。方法:乳鼠心肌细胞,以心钠素(ANF)、脑钠肽(BNP)mRNA表达作为心肌肥大指标,观察含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒转染对心肌细胞的作用,并观察CaN抑制剂环孢菌素A(CsA)或FK506对突变基因转染的影响。Real-time PCR检测ANF、BNP和CaN mRNA表达变化,同时行CaN活性测定。结果:转染含cTnI Asp128Tyr突变基因腺病毒的心肌细胞增大,胞内ANF和BNP的mRNA表达较空白对照组、不含任何目的基因的阴性对照腺病毒转染组和转染含野生型cTnI基因的腺病毒组增高(P<0.05)。与含野生型cTnI基因的腺病毒组相比,转染含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒组在ANF和BNP mRNA表达升高的同时存在CaN活性升高和CaN mRNA表达上调(P<0.05)。转染含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒并用CsA或FK506干预后,心肌细胞缩小,胞内ANF和BNP mRNA表达量较单纯转染含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒组降低(P<0.05),同时心肌细胞内CaN活性显著下降(P<0.05),CaN mRNA表达下调(P<0.05)。结论:cTnI Asp128Tyr突变可引起心肌细胞肥大;CaN信号通路参与了cTnI Asp128Tyr突变致心肌肥大过程的调控。

桃钙调磷酸酶B类似蛋白基因家族鉴定与分析

为了研究桃钙调磷酸酶B类似蛋白(CBLs)基因家族在桃中如何发挥作用。利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CBL家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有8个CBL家族基因,分布于桃的5条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CBL蛋白均含有4个保守的EF结构域。进化树分析表明CBLs可分为4个亚家族。TMHMM 2.0Server分析显示仅PpCBL1含有1个跨膜区。PlantsPFeatureScan分析显示PpCBL2、3和5均含有1个N-豆蔻酰化位点。NetPhos 2.0 Server结果显示PpCBLs存在着大量的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示桃CBL的功能提供重要的理论基础。

黑鲷钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)基因克隆及表达差异

钙调磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)为参与细胞内pH及细胞增殖调控的关键因子。用RACE末端PCR方法得到黑鲷CHP2(AsCHP2)基因全长cDNA,并利用生物信息学方法分析该基因的序列特征与同源性;同时利用实时荧光定量PCR方法检测AsCHP2的mRNA在黑鲷整体仔鱼,90d、180d黑鲷,杂交F_(2)(真鲷♂×黑鲷♀)及回交F_(1)(黑鲷♂×杂交F_(1)♀)的脑、心脏、肌肉、肝脏和性腺等组织中的表达。研究结果表明:(1)AsCHP2cDNA序列全长1722bp,5'-非编码区(UTR)长度69bp,3'-UTR长度1069bp,开放阅读框长度为585bp,编码194个氨基酸;其结构域包含2个EF-hand结构及1个核输出信号;其蛋白分子质量为21.87ku,理论等电点为4.89;同源建模获得了CHP2的二级与三维结构。AsCHP2基因的核苷酸序列与其他鱼类的相似性为86%~81%,编码的氨基酸序列与其他鱼类的相似性为80%~72%。邻接系统树显示了黑鲷CHP2氨基酸序列与其他鱼类的进化关系。序列比对与结构分析表明,AsCHP2基因具有典型的CHP2基因结构。(2)AsCHP2的mRNA在黑鲷的仔鱼期(5~35d)及大规格个体的脑、肝脏及肌肉组织中均有表达,在90d个体各组织中的表达量均高于在180d个体各组织中的表达量;在180d黑鲷、杂交F_(2)及回交F_(1)的个体中,基因在脑、肝脏、肌肉及性腺等不同组织中均有表达,且均在心脏中高表达、在性腺中低表达。这些结果显示,CHP2基因在海水鱼类的生长、发育过程中发挥功能。

钙调神经磷酸酶B亚基的^(125)I标记及其血脑屏障的通透性

钙调神经磷酸酶与老年性痴呆密切相关 ,为了解其 B亚基的血脑屏障的通透性 ,采用 Iodogen法对钙调神经磷酸酶 B亚基 (CNB)进行 12 5I标记 ,标记率高达 85 % ,产物 12 5I- CNB比活度为 74 0 GBq· g-1,放化纯度为 95 .7%。小鼠静脉注射 12 5I- CNB结果显示血脑屏障能够阻止完整的 CNB进入脑 。

中国北方汉族男性钙调神经磷酸酶基因多态性与有氧耐力表型的关联性研究

目的:探讨钙调神经磷酸酶基因多态性与有氧耐力表型初始值及耐力训练效果的关联性。方法:102名无训练史的青年健康男子完成18周有氧耐力训练,测试训练前后的VO2max和12km/h下的跑节省化(VO2)。采用PCR-RFLP和MALDI-TOFMS对钙调神经磷酸酶5个编码基因的55个单核苷酸多态性进行分型。结果:(1)VO2max初始值与单核苷酸多态性rs2850965和rs3804423关联;(2)VO2max训练敏感性与单核苷酸多态性rs3804358和rs4671887关联;(3)跑节省化的训练敏感性与单核苷酸多态性rs3739723关联。结论:钙调神经磷酸酶基因多态性可能部分解释有氧运动能力的个体差异性。

钙离子对钙调神经磷酸酶B亚基结构和功能的影响

应用原紫外CD光谱、内源荧光光谱以及ANS荧光光谱探究了Ca^(2+)对钙调神经磷酸酶(CN)调节亚基(CNB)结构和功能的影响.结果显示:Ca^(2+)能够激活CN磷酸酶活性提高到约1.5倍;CD谱显示结合Ca^(2+)后CNB出现α-螺旋含量上升、无卷曲含量下降、分子有序性升高等现象;!源荧光光谱显示结合Ca^(2+)导致CNB结构更加紧凑;ANS荧光光谱显示Ca^(2+)结合导致其疏水性增强.结合Ca^(2+)后,CNB分子有序性升高,结构更加紧凑,疏水表面暴露.这些结构变化促进了其与CNA的结合并激活了CNA的磷酸酶活性.

IGF-1介导的钙调神经磷酸酶信号通路在心肌肥厚中的作用及人参皂苷Rb1的干预效应

目的通过建立大鼠心肌肥厚模型观察人参皂苷Rb1对胰岛素样生长因子-1（IGF-1）介导的心肌肥厚的影响。方法采用手术缩窄腹主动脉的方法建立大鼠心肌肥厚模型。40只大鼠随机分为手术组（模型组、Rb1组、缬沙坦组，每组10只）及假手术组（10只）。4组大鼠分别给予相应处理，常规饲养6周后：测定颈动脉收缩压，计算左心室肥厚指数（LVMI），ELISA法测定大鼠血清IGF-1水平，Masson染色观察心肌组织变化，Westernblot法测定大鼠心肌组织钙调神经磷酸酶（CaN）的含量。结果与假手术组比较，手术组大鼠的颈动脉收缩压、LVMI、IGF-1及CaN均明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；与模型组比较，Rb1组的颈动脉收缩压、LVMI、IGF-1及CaN均明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论人参皂苷Rb1能有效抑制大鼠的心肌肥厚，其作用可能与降低IGF-1及其下游通路CaN的表达有关。

钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究

目的:基于小动物活体成像检测技术,探讨重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(rhCNB)的肝癌靶向性。方法:采用肿瘤组织块法建立BALB/c裸小鼠荷人肝癌细胞SMMC-7721原位肝癌模型。原位肝癌模型建立第14天时,按荷瘤动物体重大小随机分为FITC标记的rhCNB(rhCNB-FITC)给药组和FITC对照组,每组12只,各取6只分别用于给药后2 h、24 h剖解取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏用小动物活体成像系统进行荧光检测。另取未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠随机分为rhCNB-FITC给药组和空白对照组,rhCNB-FITC给药组12只,各取6只分别用于给药后2 h、24 h剖解取相同的脏器进行荧光检测。空白对照组6只,剖解取出相同的脏器进行荧光检测。结果:rhCNB-FITC给予未接种肿瘤的正常动物2 h时,主要分布于动物的肾脏、肝、胃、心和肺,脾脏未见明显分布;24 h时,主要分布于动物的肾脏,肝、胃、心、肺和脾脏未见明显分布。在原位肝癌模型试验中,rhCNB-FITC给药2 h时,主要分布于肝肿瘤、肾脏、肺、胃和心脏等组织器官,脾脏内未检测到明显荧光;FITC给药组只有在肝和胃组织中能检测到荧光,而且荧光强度明显弱于rhCNB-FITC给药组;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部(包括正常组织和肝肿瘤组织)的荧光强度比较,P<0.01,具有显著统计学意义。rhCNB-FITC给药24 h时,主要聚集在肝肿瘤、胃、肾脏和肺等组织器官,其中rhCNB在肝肿瘤部位的浓度最高;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝肿瘤部的荧光强度比较,P<0.05,具有统计学意义。结论:重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基具有良好的肝癌靶向性。