钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对癌细胞迁移能力的影响研究

轻链钙调蛋白结合蛋白(light-chain caldesmon,l-CaD)是一种肌动蛋白结合蛋白,它通过与肌动蛋白结合而稳定胞内微丝结构,在磷酸化作用下则能从微丝上脱离.在众多非转移性癌细胞以及永生化的正常细胞系中,l-CaD的表达量很低甚至没有,但在高迁移活性的转移性癌细胞中,l-CaD表达量显著上升,因此l-CaD可能是维持转移性癌细胞高迁移能力的重要因素.为了探索l-CaD如何调节转移性癌细胞迁移活性及其所处地位,以人源转移性乳腺癌细胞MDAMB-231作为载体,一方面,在胞内高表达外源野生型l-CaD及其磷酸化突变株,干扰胞内l-CaD的磷酸化进程,从而考察l-CaD磷酸化对细胞迁移的调节,另一方面,利用siRNA技术,抑制l-CaD在MDAMB-231细胞内的表达量,检测l-CaD对转移性癌细胞迁移活性的总体影响.通过细胞骨架荧光染色、细胞迁移小室、单细胞层次上的牵张力测定以及细胞基底脱黏附能力测定,结果显示:a.阻断MDAMB-231胞内l-CaD的磷酸化进程将显著抑制细胞的迁移能力,细胞骨架调整受阻,基底牵张力增加,细胞基底脱附能力下降;b.l-CaD表达抑制的MDAMB-231细胞失去了完整的细胞骨架,其迁移能力显著降低并与非转移性癌细胞MCF-7类似,而细胞骨架解聚导致MDAMB-231细胞基底牵张力显著减少,更容易从基底脱附.总的来说,l-CaD磷酸化是调节转移性癌细胞高迁移活性的重要分子开关,l-CaD的高表达与高效磷酸化循环是维持转移性癌细胞高迁移活性的关键因素.探索了l-CaD调节转移性癌细胞迁移活性的机制,也为认识转移性癌细胞的本质提供了新的思路.

钙调蛋白结合蛋白在子宫平滑肌肿瘤诊断中的意义

目的 探讨高度敏感和特异的诊断子宫平滑肌肿瘤的指标。方法 选取子宫内膜间质肉瘤 2 6例 ,子宫普通型和富于细胞性平滑肌瘤各 2 5例 ,子宫平滑肌肉瘤 17例 ,正常子宫肌层和正常子宫内膜各 2 5例 ,采用免疫组化 S-P法检测各种组织中结蛋白、平滑肌肌动蛋白、雌激素受体以及重型钙调蛋白结合蛋白 (h-caldesmon)的表达。结果 正常的子宫肌层、子宫普通型平滑肌瘤、富于细胞性平滑肌瘤和子宫平滑肌肉瘤中重型钙调蛋白结合蛋白的表达分别为 10 0 .0 %、10 0 .0 %、96.0 %和 64.7% ,但正常子宫内膜和子宫内膜间质肉瘤细胞中均未见其表达。重型钙调蛋白结合蛋白诊断富于细胞性平滑肌瘤不仅敏感度高于结蛋白 ,而且特异度达 10 0 .0 %。

脑型一氧化氮合成酶的钙调蛋白结合区的表达及活性鉴定

用ＰＣＲ法克隆出ｎＮＯＳ的ＣａＭ结合区基因（ｎＮＯＳ２４５５～２９８８ｂｐ），并在大肠杆菌中进行了高效表达。经金属离子螯合亲和层析得到纯度为９０％以上的重组蛋白，分子量为２２ｋＤａ，ＣａＭＯｖｅｒｌａｙａｓａｙ证实该蛋白具有ＣａＭ的结合活性。由于所表达的重组蛋白既具有序列特异性又具有ＣａＭ的结合活性，因此，可将它作为筛选ｎＮＯＳ特异性抑制肽的靶蛋白，亦可用于特异性抗体的制备。

敲低钙调磷酸酶结合蛋白1引起肾小管上皮细胞线粒体损伤

目的探讨钙调磷酸酶结合蛋白1(calcineurin binding protein 1, Cabin1)在肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)线粒体损伤中的作用机制。方法采用siRNA干预体外培养RTECs,敲低Cabin1的表达,继而以电镜观察其对RTECs线粒体形态的影响。结果在对照组和阴性对照组中Cabin1蛋白在RTECs中有高表达,采用siRNA干预RTECs后,Cabin1蛋白的表达量较对照组和阴性对照组降低50%以上(P<0.05)。对照组与阴性对照组中,线粒体形态规则,呈圆形或椭圆形,线粒体膜完整,线粒体嵴清晰可见。敲低组中,线粒体肿胀,呈长条形或不规则形,线粒体膜、线粒体嵴结构模糊甚至消失。结论敲低Cabin1引起RTECs的线粒体形态学异常,提示Cabin1是维持RTECs线粒体正常功能的重要分子。

La^(3+)诱导钙调蛋白与鼠脑组织钙调蛋白亲合蛋白的结合

应用固定化钙调蛋白(CaM)亲合色谱法、变性丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等方法研究了La3+诱导CaM在大鼠脑匀浆液中的钙调蛋白亲合蛋白(CaMBP)谱以及CaM-CaMBP在模拟细胞环境下结合作用的La3+浓度依赖关系,并与Ca2+的作用进行了比较.实验结果表明,(1)La3+参与的CaMBP物种与Ca2+的基本相同.鉴定了其中含量高且稳定出现的5种CaMBP分别是参与糖酵解反应的6-磷酸果糖激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶、细胞骨架类的微管蛋白和肌动蛋白以及应激反应相关的71000热休克同源蛋白,表明稀土离子可能参与多种细胞过程;(2)La3+诱导CaM与5种CaMBP结合的浓度依赖曲线因CaMBP物种的不同而存在差别.热休克同源蛋白、肌动蛋白或微管蛋白对La3+相对敏感,La3+在金属-CaM-CaMBP三元体系中与CaM的结合常数K与Ca2+的相近或稍高;而6-磷酸果糖激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶体系对La3+的敏感性明显低于Ca2+.其原因可能在于模拟细胞环境的复杂性以及CaM-CaMBP蛋白质相互作用对金属离子与CaM配位结合的调节.

果蝇TRP离子通道C端一个新钙调蛋白结合位点的鉴定和分析

瞬时受体电位（TRP）通道是一类钙离子透过性的阳离子通道蛋白家族,参与了视觉、味觉、温度感受等重要的生物学过程。之前的研究表明,钙离子既能够正反馈也能够负反馈地调节瞬时受体电位通道的活性,而这种调节可能是通过钙调蛋白（calmodulin,CaM）与TRP通道的相互作用来进行的。为了阐明这一调控机制,我们首先需要对钙调蛋白与瞬时受体电位通道之间的相互作用进行详细的生化研究。在此项研究中,通过大肠杆菌表达系统,表达和纯化了果蝇瞬时受体电位通道羧基末端不同长短的蛋白片段,并发现了一个新的钙调蛋白结合位点。通过快速蛋白液相色谱、静态光散射以及等温量热滴定技术,鉴定了这一钙调蛋白结合位点与果蝇瞬时受体电位通道之间的相互作用,发现它们在钙离子依赖的条件下,可以形成亲和力非常强的稳定的蛋白复合物（解离常数在0.1~1微摩尔范围）。此外,通过合成多肽的方法,鉴定了果蝇瞬时受体电位通道913~939片段为该钙调蛋白结合位点的核心区域。最后,通过突变实验,进一步明确了果蝇瞬时受体电位通道922位的酪氨酸以及923位的缬氨酸为其钙调蛋白结合位点的关键氨基酸。总而言之,本研究发现和鉴定了果蝇瞬时受体电位通道上一个新的钙依赖的钙调蛋白结合位点,这一发现将为研究瞬时受体电位通道的体内功能提供生化基础,为阐明钙离子通过钙调蛋白调节瞬时受体电位通道的分子机制做出贡献。

钙调磷酸酶结合蛋白1在5/6肾切除大鼠肾小管上皮细胞损伤时高表达

目的探讨钙调磷酸酶结合蛋白1(calcineurin binding protein 1,Cabin1)在肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)损伤中的作用。方法雄性SD大鼠随机分成假手术组和5/6肾切除组,后者进一步分成术后4和8周组。肾切除后4和8周检杀大鼠,取肾组织行Masson染色和肾小管-间质损伤评分(tubulointerstitial lesion score,TILS),电镜观察RTECs线粒体形态,WB检测肾组织中Cabin1表达。结果随造模时间延长,术后8周出现RTECs脱落、间质炎症细胞浸润及弥漫性纤维化;TILS逐渐升高,术后8周组与假手术组相比,差异具有统计学意义(7.16±0.52 vs.0.00±0.00,P<0.05)。术后4周RTECs线粒体肿胀、形状不规则,术后8周出现线粒体膜、线粒体嵴结构模糊甚至消失。残肾中Cabin1蛋白表达明显升高,术后8周与假手术组(0.97±0.09 vs.0.22±0.07)、术后8周与4周组相比(0.97±0.09 vs.0.45±0.03),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Cabin1在RTECs损伤时高表达,其可能是调控RTECs损伤的重要靶点。

钙调磷酸酶结合蛋白1在足细胞线粒体损伤中的表达

目的探讨钙调磷酸酶结合蛋白1(Cabin1)在足细胞线粒体损伤中的作用机制。方法采用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激体外培养足细胞,分刺激后0、24和48 h组,行免疫荧光和WB检测Cabin1在足细胞线粒体损伤时的分布及表达。结果 0 h组,细胞骨架分子F-actin呈强有力的丝状分布,Cabin1均匀分布于胞浆和胞核;24 h组,F-actin出现不连续分布,Cabin1在胞浆的分布减少,趋向胞核分布;48 h组,F-actin排列明显紊乱,Cabin1在胞核的聚集更显著。24 h和48 h组,线粒体功能指示分子-细胞色素C蛋白分别为0 h组的1.51和1.87倍,Cabin1则分别达0 h组的1.33和1.67倍(P<0.05)。结论 Cabin1在足细胞细胞骨架破坏和线粒体损伤时表达升高,可能是调控足细胞线粒体功能的重要分子。

活性氧簇及抗氧化剂对钙调神经磷酸酶作用的研究

目的:研究活性氧簇(ROS)及抗氧化剂对钙调神经磷酸酶的作用。方法:测定并比较对照黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶ROS生成系统作用下及与超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶、甘露醇或二巯基苏糖醇(DTT)共同作用下钙调神经磷酸酶的活性。结果:黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生的ROS使钙调神经磷酸酶活性下降33.1%。SOD、过氧化氢酶、DTT可显著减少ROS对钙调神经磷酸酶活性的抑制。结论:钙调神经磷酸酶受氧化还原作用调节。

环孢霉素A对肾性高血压大鼠重要脏器钙调神经磷酸酶活性的调控(英文)

背景：近来大量研究表明，钙调神经磷酸酶依赖的信号转导通路在免疫系统、神经系统、心血管系统具有广泛的生物学效应，钙调神经磷酸酶活性改变与多种疾病发生发展密切相关。 目的：通过建立一肾一夹肾性高血压大鼠模型，观察高血压大鼠心脏、脾、肾脏、肺、脑、肝、主动脉等重要组织脏器钙调神经磷酸酶活性变化及环孢霉素A的调控作用。 设计：完全随机分组设计，对照实验。 单位：解放军总医院南四科。 方法：实验于2002-11／2003-06在解放军总医院老年外科实验室完成。选用雄性Wistar大鼠(清洁级)20只。动物随机分为3组：肾性高血压组[n=7，行一肾一夹手术，术后第4天开始给予生理盐水1mK／(kg·d)腹腔注射，9g／L盐水代饮水至4周]，环孢霉素A干预组(n=7，行 肾一夹手术后第4天给予环孢霉素A5mg／(kg·d)腹腔注射，9g／L盐水代饮水至4周)，假手术组(n=6，除不切除右肾及狭窄左肾动脉外，其余操作同手术组，假手术后第4天开始给予生理盐水1mL／(kg·d)腹腔注射，正常饮水至4周)。一肾一夹模型制作方法：将大鼠腹腔注射麻醉后，行右肾切除，左肾用直径0．2mm银夹狭窄左肾动脉。采用tail-cuff测压法测鼠尾收缩压。以对硝基磷酸酚为底物测定术后4周大鼠各组织器官钙调神经磷酸酶活性。两组差异性比较采用成组资料t检验。 主要观察指标：①各组大鼠各重要组织及器官钙调神经磷酸酶活性比较。②各组大鼠术前及术后4周收缩压比较。 结果：大鼠20只均进入结果分析。①收缩压：术前三组大鼠相近(P>0．05)。术后4周环孢霉素A干预组低于肾性高血压组，但差异不明显；肾性高血压组和环孢霉素A干预组大鼠均明显高于假手术组(t=2．54，3．01，P<0．05)。②肾、肺、心、脾、脑组织钙调神经磷酸酶活性：肾性高血压组大鼠明显高于假手术组(t=3．17～7．08，P<0．05)，环孢霉素A干预组明显低于肾性高血压组(t=2．91～7．25，P<0．05)。③肝细胞钙调神经磷酸酶活性：肾性高血压组和环孢霉素A干预组均明显低于假手术组(t=2．63，2．83，<0．05)。④主动脉钙调神经磷酸酶活性：各组大鼠相近。 结论：①肾性高血压大鼠心、脑、肾脏、脾脏、肺脏组织钙调神经磷酸酶活性均有显著升高，环孢霉素A对肾性高血压大鼠上诉各组织脏器钙调神经磷酸酶活性具有广泛的抑制作用。②环孢霉素A无明显降肾性高血压大鼠收缩压作用。

钙调神经磷酸酶在心血管系统中的作用

目的:钙调节神经磷酸酶是目前惟一已知的细胞内钙/钙调素依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在细胞信号传递过程中直接受钙的调节,起去磷酸化作用。就钙调节神经磷酸酶的酶学特性、分布、生物学功能及其与心血管系统的关系作一综述。资料来源:检索Medline1995-01/2005-12及清华同方数据库1994-01/2005-12的相关文章,检索词“calcineurin”,并限定文章语言种类为English。检索词“钙调节神经磷酸酶”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,纳入标准:钙调节神经磷酸酶的酶学特性、分布、生物学功能及其与心血管系统关系的实验研究文章。排除标准:重复研究、综述、Meta分析。资料提炼:共收集到95篇关于钙调节神经磷酸酶的酶学特性、分布、生物学功能及其与心血管系统关系的实验研究的文献,30篇符合纳入标准。排除的65篇中包括重复研究、综述、Meta分析。资料综合:①近年发现,钙调节神经磷酸酶-T细胞活化核因子途径广泛存在于心肌骨骼肌、血管平滑肌细胞等,参与心肌和骨骼肌肥大、成纤维细胞增殖的发生。②钙调节神经磷酸酶为一个催化亚单位(CnA)和一个调节亚单位(CnB)组成的异源二聚体,有3种主要同工酶:CaNα,CaNβ,CaNγ。钙/钙调素与钙调节神经磷酸酶结合后诱发CnA构象的改变,致使自身抑制域移位,暴露出活性位点,产生钙调节神经磷酸酶的活化。③钙调节神经磷酸酶使胞浆转录因子NF-ATS脱磷酸化,暴露其核定位信号,NF-ATS得以转位入核,与核内其他转录因子协同调节多种基因的活化。在免疫应答中的重要作用,参与细胞生长,凋亡。④钙调节神经磷酸酶信号通路启动血管发育及后期血管与周围组织之间的有联,钙/钙调节神经磷酸酶/NF-ATC在正常心瓣和心膈形成的信号转导过程中发挥重要作用,对心脏的正常形态学发生至关重要。结论:钙调节神经磷酸酶在心血管系统的正常生理结构与功能的维持以及病理生理过程中均发挥着重要作用。调节神经磷酸酶信号通路在心血管系统生理及病理生理中的反作用的证实,以及对其作用机制、抑制剂的深入研究,对探讨心血管疾病的发病机制、正常心血管功能的调节机制有重要意义。

心肌肥厚大鼠心肌组织中钙调神经磷酸酶抑制因子的信号转导

目的:观察醛固酮诱导心肌肥厚大鼠心肌组织钙调神经磷酸酶抑制因子表达和心肌钙调神经磷酸酶活性及血浆中醛固酮和血管紧素II水平的变化。方法:实验于2003-08/12在解放军总医院老年病研究所实验室完成。选用健康雄性Wistar大鼠21只。随机分为3组,每组7只,分别为正常对照组和心肌肥厚组及环孢素A组。①分组干预:正常对照组:皮下注射等量生理盐水,10g/L盐水饮用,连续14d;心肌肥厚组:皮下注射醛固酮18μg/d,10g/L盐水饮用,连续14d复制心肌肥厚模型。环孢素A组:除皮下注射醛固酮18μg/d外,同时以环孢素A5mg/(kg·d)皮下注射14d,10g/L盐水饮用,连续14d。②心肌组织钙调神经磷酸酶抑制因子测定:钙调神经磷酸酶抑制因子条带的平均密度测定采用凝胶成像分析系统完成。③血浆中醛固酮和血管紧素Ⅱ水平:采用放射免疫方法测定。④心肌钙调神经磷酸酶活性:参照发色底物法改进方法测定。结果:大鼠21只均进入结果分析。皮下注射醛固酮14d后,①血浆醛固酮水平:环孢素A组明显高于心肌肥厚组和正常对照组[(0.75±0.17),(0.28±0.06),(0.21±0.03)ng/L,P<0.05]。②心肌组织钙调神经磷酸酶活性:心肌肥厚组明显高于正常对照组[(0.40±0.09),(0.18±0.58)A410,P<0.05]。③血浆血管紧张素II水平:心肌肥厚组明显低于环孢素A组和正常对照组[(304±106),(1309±925),(448±258)ng/L,P<0.05]。④钙调神经磷酸酶抑制因子的表达:心肌肥厚组明显高于正常对照组和环孢素A组(56.26±3.37,36.26±6.19,44.71±6.58,P<0.01)。结论:①钙调神经磷酸酶抑制因子有拮抗心肌肥厚反应的作用。②在外源性醛固酮诱发大鼠发生心肌肥厚反应过程中,钙调神经磷酸酶的活性增加,而其内源性负性调节蛋白钙调神经磷酸酶抑制因子的表达亦相应增加;应用钙调神经磷酸酶特异性阻断剂环孢素A后,心肌组织内钙调神经磷酸酶的活性呈下降趋势,而钙调神经磷酸酶抑制因子的表达亦相应显著下降,提示钙调神经磷酸酶抑制因子的变化受到钙调神经磷酸酶信号转导系统调控。

针刺调节脑梗死大鼠脑血管平滑肌CaP、CaD变化的实验研究

目的:通过研究脑梗死发生后脑动脉血管平滑肌中与血管收缩相关的PKC通路中关键蛋白CaP、CaD的表达变化及针刺干预效应,研究针刺对脑梗死大鼠脑血管平滑肌CaP、CaD变化的动态调节规律。方法:以线栓法复制脑梗死大鼠模型,以脑表面血管为研究对象,应用免疫印迹法检测脑血管平滑肌CaP、CaD的变化规律和电针干预效应。结果:免疫印迹结果显示:与空白组相比模型组MCAO后各时相CaD、CaP表达量下调均有显著统计学差异(P<0.01或P<0.05);模型组和针刺组组间比较显示,针刺组CaD、CaP表达量均上调,组间比较均有显著统计学差异(P<0.01,P<0.05)。结论:针刺干预可显著抑制MCAO模型大鼠脑表面血管CaD、CaP表达下调趋势,使其维持在正常值左右,这对于缓解缺血后血管平滑肌痉挛,保证缺血区血液供应具有重要作用。

血小板衍生生长因子调节休克血管反应性的非MLC20磷酸化机制与HSP27和Caldesmon的关系

目的初步探讨非MLC20磷酸化途径在休克后血管低反应性中的调节作用及与钙调结合蛋白（Caldesmon）和热休克蛋白（HSP27）的关系。方法 SD大鼠48只,200-250g,雌雄不拘。取大鼠肠系膜血管环,观察缺氧后血管反应性和肌球蛋白轻链20（MLC20）磷酸化的变化,及对HSP27和Caldesmon活性的影响。采用反义寡核苷酸（AODN）抑制HSP27和Caldesmon后,观察血小板衍生生长因子（PDGF）调节血管反应性和MLC20磷酸化的变化。结果失血性休克后,血管反应性显著降低,不同浓度的PDGF（40、60、80、100ng/ml）可以增加休克后的血管反应性,且呈现剂量依赖性;然而不同浓度的PDGF（40、60、80、100ng/ml）对MLC20磷酸化的影响未呈剂量依赖性增加,但不同浓度的PDGF在调节Caldesmon和HSP27磷酸化时却呈现剂量依赖性,而且Caldesmon和HSP27的反义寡核苷酸可以抑制PDGF引起的血管反应性的增加,却不能抑制PDGF引起的MLC20磷酸化水平的增加。结论非MLC20磷酸化途径参与休克后血管反应性的调节,其机制与Caldesmon和HSP27相关。

类肌钙蛋白和钙调蛋白结合蛋白在胃肠运动及其病理适应性调节中的作用

目的 研究类肌钙蛋白 (calponion ,CaP)和钙调蛋白结合蛋白 (caldesmon ,CaD)在胃肠道中的表达及其在胃肠运动病理适应性调节中的作用。方法 通过建立慢性番泻叶诱导的胃肠运动增强和实验性肝硬化胃肠运动减弱 2种动物模型 ,应用SDS PAGE和Westernblot方法检测不同胃肠运动状态下胃肠道平滑肌组织中CaP和CaD的表达 ,并用图像分析进行定量比较。结果 建立了慢性番泻叶诱导的胃肠运动增强和实验性肝硬化胃肠运动减弱 2种动物模型。正常小鼠和大鼠胃肠道组织中CaP和CaD的含量依次为结肠 >胃 >小肠 ;慢性胃肠运动增强小鼠肠道组织中CaP和CaD的含量下降 ;实验性肝硬化胃肠运动减弱大鼠胃肠道组织中CaP和CaD的含量显著增加 ,而经左旋硝基精氨酸甲基酯治疗胃肠运动恢复后 ,它们的含量亦恢复至正常。结论 CaP和CaD的表达与胃肠道各部分的运动状态密切相关 ,胃肠道运动增强 ,其含量减少 ,胃肠道运动减弱则其表达增高。提示这2种蛋白质分子参与了胃肠运动的调节和病理适应性调节过程。

钙调蛋白结合蛋白通过调节细胞骨架稳定性影响肿瘤细胞运动能力

轻链钙调蛋白结合蛋白(light-chain Caldesmon,l-CaD)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白,普遍存在于众多非肌肉细胞中。体外研究证明,l-CaD能通过与肌动蛋白的结合起到促进原肌动蛋白(G-actin)聚合、稳定肌动蛋白纤维(F-actin)结构的作用。在磷酸化作用下,l-CaD能从肌动蛋白纤维上脱离并促进肌动蛋白纤维的解聚。该研究拟考察l-CaD在细胞内对细胞肌动蛋白骨架的调节作用,阐明l-CaD对细胞运动能力的影响,作者将天然低表达l-CaD的人源性乳腺癌细胞MCF-7作为细胞模型,在MCF-7胞内以基因转染的方式高表达外源野生型l-CaD及其磷酸化突变株A1234-CaD(不可磷酸化CaD)、D1234-CaD(完全磷酸化CaD)。首先,通过激光共聚焦扫描,探讨了l-CaD对细胞骨架重排的调节;其次,通过细胞迁移transwell阵列,检测了l-CaD对细胞迁移能力的影响;最后,在单细胞层次上测定了细胞基底牵张力、胰酶刺激下的细胞基底脱附能力,并进一步检测了l-CaD对细胞迁移子过程中细胞伸张、收缩的影响。研究结果显示,l-CaD在胞内对细胞骨架的形成有显著的调控作用。非磷酸化l-CaD主要富集在细胞骨架上,增强了细胞骨架的强度,导致细胞基底牵张力以及对胰酶的耐受性增强,但对细胞的迁移能力有显著的抑制作用;磷酸化l-CaD跟细胞骨架结合能力很弱,对细胞的运动能力没有显著影响。通过磷酸化,l-CaD起到了一个"蛋白开关"的作用,通过控制细胞骨架的解聚、重排来调节细胞的运动能力。

脑膜瘤E-钙粘连素的表达及生物学行为

目的:探讨脑膜瘤中E-钙粘连素的表达和临床病理学意义。方法:应用免疫组织化学S-P法检测67例脑膜瘤组织中E-钙粘连素表达情况,并结合临床病理参数进行综合分析。结果:E-钙粘连素的表达与脑膜瘤病理分级、侵袭行为、瘤周水肿显著相关(P<0.05)。结论:E-钙粘连素在脑膜瘤侵袭行为、瘤周水肿等方面起着重要作用,检测E-钙粘连素的表达对进一步了解脑膜瘤的生物学行为和判断预后有重要价值。

CPI-17对平滑肌细胞的调节作用及其机制

协同调控收缩是平滑肌的关键属性,其收缩功能正常,有助于维持机体整体健康;如发生功能失调,会增加疾病发病率和病死率。蛋白激酶C加强的磷酸酶抑制剂17(protein kinase C-potentiated phosphatase inhibitorof 17 ku,CPI-17)是磷酸化依赖的肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)抑制蛋白,其可增加肌球蛋白轻链(20 ku myosin light chain,MLC20)磷酸化水平,增强平滑肌收缩。CPI-17功能受多种蛋白激酶和磷酸酶的调节。近年研究发现,在病理生理条件下,其表达和活性上调或下降与子宫、血管、气管、胃肠道等多种平滑肌功能密切相关。针对CPI-17对平滑肌细胞的调节作用及机制的深入研究有助于进一步阐明平滑肌功能障碍相关疾病及其功能失调的发病机制,并为其临床治疗提供新思路。

串联亲和纯化标记的HMGB1细胞因子诱导片段1融合表达载体构建和蛋白纯化及其功能初步探讨

目的:构建高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中细胞因子诱导片段1(CIF1)与串联亲和纯化(TAP)系统中纯化标签链霉亲和素结合肽(SBP)和钙调蛋白结合肽(CBP)序列相融合的原核表达载体,观察重组蛋白对小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,为HMGB1参与炎症反应作用机制的研究以及CIF1结构域细胞膜表面受体蛋白的获得和鉴定奠定基础。方法:采用PCR方法分别扩增出CBP-SBP和CIF1的编码序列,构建表达质粒pET-14b/CBP-SBP-CIF。利用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白,纯度达85%以上。采用纯化后的蛋白诱导小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞RAW264.7,利用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测RAW264.7细胞释放TNF-α的水平变化。结果:表达载体构建正确,CIF1重组蛋白表达量高,纯度好。当蛋白浓度大于0.5ng/μl时,CIF1重组蛋白诱导细胞TNF-α的分泌量与对照组相比差异具有显著性(P<0.05),并且在CIF1蛋白浓度0～2.5ng/μl范围内,TNF-α的分泌量与CIF1重组蛋白的浓度呈显著的剂量依赖关系。结论:原核表达纯化了His-CBP-SBP-CIF1融合蛋白,该融合蛋白可以有效地作用于巨噬样细胞内的信号转导过程,介导了炎症因子TNF-α的分泌表达。

MYOZ2通过负调控TCAP的表达促进C3H10T1/2细胞成脂分化

本研究旨在明确钙调磷酸酶肌小节结合蛋白2(myozenin2,MYOZ2)的组织表达特性,阐明其对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响及可能的作用机制。采集180日龄马身猪、60日龄ICR小鼠、35日龄罗斯肉鸡和12月龄小尾寒羊背最长肌、皮下脂肪和肝组织,检测MYOZ2基因mRNA表达。结果显示,MYOZ2基因在所检测的物种中表现出相似的组织表达规律,在背最长肌表达量最高,皮下脂肪与肝组织低水平表达。在C3H10T1/2细胞中沉默MYOZ2基因后,qRT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂关键基因PPARγ、FABP4表达极显著下调(P<0.01);Western印迹结果表明,PPARγ蛋白含量显著降低(P<0.05);油红O染色发现,沉默MYOZ2基因后脂滴数明显减少,甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。利用qRT-PCR技术检测沉默MYOZ2基因后,脂肪代谢相关基因SCD、FASN、SREBP1、NR1H3、DGAT1、PNPLA2、HSL、CES1、CPT1等的表达,结果显示,SCD、FASN、SREBP1、PNPLA2、HSL极显著下调(P<0.01),NR1H3显著下调(P<0.05),DGAT1表达下调但差异不显著,CES1、CPT1显著上调(P<0.05)。利用STRING数据库构建MYOZ2相关蛋白质互作网络图,发现MYOZ2可能通过肌联蛋白帽(Titin-cap,TCAP)与PPARγ相互作用进而影响成脂分化。沉默TCAP基因,qRT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂关键基因PPARγ、FABP4表达极显著上调(P<0.01);Western印迹结果表明,与对照组相比,PPARγ蛋白含量显著升高(P<0.05);油红O染色发现,沉默TCAP基因后脂滴数明显增多,甘油三酯含量显著升高(P<0.05)。利用qRT-PCR技术检测沉默MYOZ2后TCAP基因的表达结果显示,沉默MYOZ2后TCAP的表达极显著升高(P<0.01)。综上所述,MYOZ2基因在背最长肌中表达量最高,在皮下脂肪和肝组织中也有少量表达。此外,MYOZ2可能通过MYOZ2-TCAP-PPARγ途径影响成脂关键基因PPARγ和FABP4的表达,进而调控脂肪酸代谢相关基因SCD、FASN、SREBP1、NR1H3、DGAT1、PNPLA2、HSL、CES1、CPT1,在成脂分化过程中发挥重要作用。