钙非依赖型磷脂酶A_(2)介导心肌缺血再灌注损伤

目的:探讨钙非依赖型磷脂酶A_(2)(Ca^(2+)-independent PLA_(2),iPLA_(2))在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法:采用CRISPR方法构建iPLA_(2)基因敲除(iPLA_(2)^(-/-))小鼠,通过结扎C57BL/6JNifdc小鼠的左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型,采用蛋白质印迹法检测iPLA_(2)蛋白的表达;全自动生化分析仪检测血清心肌酶的活性;间接免疫荧光标记法检测CD68的表达。结果:野生型小鼠心肌缺血再灌注中,缺血45 min再灌注3 h时iPLA_(2)蛋白的表达最高。与野生型心肌缺血再灌注小鼠比较,iPLA_(2)^(-/-)小鼠心肌缺血再灌注损伤得到改善,表现为血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的漏出减少和CD68阳性细胞数减少。结论:iPLA_(2)蛋白的高表达是小鼠心肌缺血再灌注损伤的重要原因,iPLA_(2)可能是治疗心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点。

钙非依赖型磷脂酶A_2对过氧化氢诱导胰岛微血管内皮细胞凋亡的影响

目的用过氧化氢(H_2O_2)诱导大鼠胰岛微血管内皮细胞(IMECs)凋亡,观察钙非依赖型磷脂酶A_2(iPLA_2)对其凋亡的影响。方法 siRNA技术抑制IMECs iPLA_2表达,DNA ladder法检测H_2O2诱导后的DNA片段,Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡率,DIOC_6(3)染色检测细胞线粒体膜电位。结果 (1)siRNA-iPLA_2可明显抑制IMECs内iPLA_2 mRNA的表达。(2)H_2O_2诱导后细胞DNA片段化程度随诱导时间的增加而增多,抑制iPLA_2表达后细胞的梯状条带明显增亮。(3)干扰组和未干扰组、干扰阴性对照组相比凋亡率明显升高(P均<0.01)。(4)与未干扰组比较,干扰组细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.1)。结论抑制iPLA_2表达可促进H_2O_2诱导的IMECs凋亡。

沉默钙非依赖型磷脂酶A2β基因对间歇性高糖诱导胰岛微血管内皮细胞凋亡的影响

目的 通过小分子干扰（siRNA）技术沉默大鼠胰岛微血管内皮细胞（IMECs）的钙非依赖型磷脂酶A2（iPLA2）基因,研究不同葡萄糖浓度对IMECs iPLA2表达的影响及其与细胞凋亡之间的关系.方法 通过分离纯化大鼠胰岛,获取IMECs细胞,采用随机数余数分组法将其分为正常糖组（5 mmol/L）、恒定高糖组（28 mmol/L）及间歇高糖组（每24小时轮换培养于5mmol/L或28 mmol/L葡萄糖）;通过实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测葡萄糖浓度分别为恒定的5 mmol/L、28 mmol/L以及每24小时轮换的5 mmol/L或28 mmol/L培养条件下的IMECs iPLA2的基因表达;合成iPLA2的RNA干扰序列并转染至IMECs中,通过RT-PCR验证其是否转染成功;采用细胞DNA片段化检测和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V/PI）流式细胞仪检测不同葡萄糖浓度条件下IMECs的凋亡.组间两两比较采用LSD检验,凋亡率采用随机区组设计的两因素ANOVA分析.结果 RT-PCR检测显示各组细胞iPLA2基因表达逐渐减弱,依次为1.90±0.23、0.90±0.05及0.23±0.03,且各组间差异有统计学意义（P＜0.05）.成功合成并转染iPLA2 siRNA后,IMECs间歇性葡萄糖培养组较正常糖组及恒定高糖组DNA片段化更为明显,间歇高糖组流式细胞凋亡率较正常糖组升高,差异有统计学意义（44.9±2.7比3.1±1.0,P＜0.05）.结论 间歇性高糖环境可抑制IMECsiPIA2基因表达,且通过小分子干扰技术抑制iPLA2基因表达能够促进细胞的凋亡,提示iPLA2表达减弱可能参与了间歇性高糖诱导的IMECs凋亡过程.

非钙依赖型磷脂酶A2相关性神经变性病5例并国内文献复习

目的探讨国内非钙依赖型磷脂酶A2相关性神经变性病(PLAN)临床表型和PLA2G6基因型特点。方法回顾性收集2016年6月至2019年5月复旦大学附属儿科医院确诊PLAN患儿的临床资料,并以"PLA2G6"和"脑组织铁沉积神经变性病"为检索词在"中国知网、万方、维普、Pubmed"数据库检索2006年1月至2020年3月我国学者报道PLAN病例的文献,总结分析国内PLAN表型和基因型特点。结果 5例患儿均为婴儿神经轴索营养不良(INAD),发病年龄中位数18月龄,首发症状中4例为发育倒退,1例为步态不稳,1例合并癫痫,表现为痉挛和局灶性发作。神经系统查体中除1例肌力正常外,4例肌力为1~4级,1例病理征阳性,4例深反射活跃,1例深反射亢进。头颅磁共振成像(MRI)检查中3例小脑萎缩。3例行肌电图均提示神经源性损害改变。4例进行随访,现存肌力0~3级,3例完全丧失语言能力。本组5例均具有PLA2G6复合杂合变异,共有10种不同变异,错义变异(50%),7种未在人类基因突变数据库(HGMD)中报道。文献复习:14年间共检索到12篇文献,报道43例PLAN,其中36例(83.7%)为INAD,3例(7.0%)为不典型INAD,4例(9.3%)为PLA2G6相关性肌张力障碍-帕金森综合征(PLAN-DP)。6例(14.0%)合并癫痫,5例癫痫发作类型为局灶性发作或全面性强直。10例临床诊断INAD,33例经分子遗传学明确诊断。43例共检测到PLA2G6基因49种变异类型,其中错义变异27种(55.1%)。结论 INAD是PLAN最常见的临床表型,同时存在周围神经和中枢神经损害,且病情进展迅速是其主要特点。PLA2G6以错义变异为主,未发现热点变异位点,目前尚无有效治疗方法。

iPLA2β通过调控铁死亡减轻高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤

目的探讨钙离子非依赖型磷酸酯酶A2β(iPLA2β)在高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达,iPLA2β与铁死亡的关系以及iPLA2β对高糖诱导的HK-2细胞损伤的保护机制。方法用30 mmol/L葡萄糖刺激HK-2细胞,iPLA2β质粒转染构建过表达模型,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)和铁死亡激活剂erastin作为铁死亡对照组。干预36 h后,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、铁含量,DCF免疫荧光检测细胞内活性氧(ROS)水平。Western blot法检测铁死亡指标ACSL4、GPX4、LPCAT3、TFR1的表达。结果高糖刺激可以降低HK-2细胞内iPLA2β的表达,HK-2细胞内ROS、MDA水平升高,GSH、SOD水平降低。Western blot结果显示ACSL4、LPCAT3、TFR1表达增高,GPX4表达降低。Fer-1干预后上述指标改善。过表达iPLA2β后,可降低KIM-1表达,减轻HK-2细胞损伤。进一步研究发现,过表达iPLA2β后可抑制高糖诱导的HK-2细胞的氧化应激和铁死亡。另外,erastin减弱了iPLA2β对高糖诱导的HK-2细胞损伤的保护作用。结论iPLA2β通过调控铁死亡减轻高糖诱导的HK-2细胞损伤。