自发性癫痫大鼠海马电压门控性钠通道β_1亚基表达与基因突变分析

目的与正常Wistar大鼠作对比,探讨自发性癫痫大鼠(SER)海马中电压门控性钠通道β1亚基mRNA与蛋白的表达情况及基因突变分析。方法应用RT-PCR技术检测β1亚基mRNA的表达;免疫组化方法定位β1亚基蛋白;免疫印迹方法检测β1亚基蛋白的表达;直接测序技术筛查β1亚基全部外显子基因突变位点。结果SER海马β1亚基mRNA表达高于Wistar大鼠(P<0.05);免疫组化结果显示β1亚基蛋白在SER大鼠海马各区中均有表达,且位于细胞膜上;β1亚基蛋白的表达高于Wistar大鼠(P<0.01);直接测序法筛查了β1亚基全部外显子的突变位点,结果未见任何突变。结论SER海马β1亚基表达异常可能会促进癫痫样兴奋活动的产生,进而构成SER癫痫表型的发作基础。

由SCN4A基因错义突变导致的严重新生儿发作性喉痉挛1例及文献复习

严重新生儿发作性喉痉挛(severe neonatal episodic laryngospasm,SNEL)是一种离子通道病,该病因钠电压门控通道4亚基(sodium voltage-gated channel alpha subunit 4 gene,SCN4A)基因突变导致反复发作性咽喉肌强直而危及新生儿生命。现报告1例在出生后出现阵发性发绀和四肢强直的新生儿病例,随访期间,患儿还出现四肢肌肥大和生长发育迟缓。全外显子测序证实该患儿存在SCN4A基因新型杂合突变(c.2395G>A,p.Ala799Thr)。卡马西平是治疗该病的有效药物。此病例扩展了我们对SCN4A基因突变表型的认识。总结已报道的16例SNEL病例特点,发现他们主要发生p.G1306E位点错义突变。相似症状表现为新生儿期上气道肌紧张和喂养困难,长大后多数患者表现为不同程度的发作性肌强直和进行性的肌肥大。一些患者出现"运动员"特征外貌,但几乎所有患者肌电图均有肌强直放电。

肌阵挛-站立不能性癫痫的临床特征及其电压门控性钠通道α1亚基基因突变检测

目的探讨肌阵挛-站立不能性癫痫（MAE）的临床特点、药物疗效及可能的分子遗传学机制。方法根据2001年国际抗癫痫联盟癫痫综合征分类标准对自2006年至2008年在广州医学院第二附属医院神经内科就诊的MAE患者进行诊断，收集患者的临床资料及外周血DNA，采用高效液相色谱分析和直接测序法对电压门控性钠通道α1亚基（SCNIA）基因突变进行筛查，并对其临床治疗情况随访1年以上。结果共收集10例MAE患者，其中散发8例，有热性惊厥或癫痫家族史者2例；起病年龄介于5～39个月间；有多种全面性发作形式；2例曾出现癫痫持续状态；起病后精神发育迟滞者7例。对其中8例患者进行SCNIA基因突变筛查，均未发现突变。丙戊酸、氯硝安定和左乙拉西坦疗效最好．部分患者托吡酯和拉莫三嗪治疗亦有效。结论MAE是少见的癫痫综合征，分子遗传学机制不明，丙戊酸、氯硝安定和左乙拉西坦治疗有效，但预后较差。

lncRNA KCNQ1OT1调控miR-384/CACNA1C轴对心肌细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA钾电压门控通道亚家族Q成员1反向转录物1(lncRNA KCNQ1OT1)调控miR-384/L型钙离子通道α1C亚基基因(CACNA1C)轴对心肌细胞增殖、凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot分别检测正常培养的大鼠心肌H9c2、CP-R073细胞及缺氧/复氧(H/R)诱导的H9c2、CP-R073细胞中的KCNQ1OT1、miR-384、CACNA1C蛋白表达。将H9c2细胞分为Ct组、Model组、si-NC组、si-KCNQ1OT1组、mimic NC组、miR-384 mimic组、si-KCNQ1OT1+inhibitor NC组、si-KCNQ1OT1+miR-384 inhibitor组。除Ct组外,其他组H9c2细胞均需转染对应物质后构建H/R损伤模型。qRT-PCR检测细胞中KCNQ1OT1、miR-384表达;CCK-8法、EdU染色检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测细胞中肌红蛋白(Mb)、肌钙蛋白-Ⅰ(cTnⅠ)水平;Western blot检测CACNA1C、增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证KCNQ1OT1与miR-384、miR-384与CACNA1C的关系。结果H/R诱导的H9c2、CP-R073细胞中KCNQ1OT1、CACNA1C蛋白表达升高,miR-384表达降低,且H/R诱导的H9c2细胞中KCNQ1OT1、CACNA1C蛋白表达最高,miR-384表达最低,因此,后续选择H9c2细胞为研究对象。与Ct组比较,Model组细胞中KCNQ1OT1、细胞凋亡率、Mb、cTnⅠ水平、CACNA1C、Caspase-3、Bax蛋白表达升高,miR-384表达、D 450值、EdU阳性率、PCNA蛋白表达降低(P<0.05);沉默KCNQ1OT1或过表达miR-384可促进H/R诱导的H9c2细胞增殖,抑制细胞凋亡;miR-384 inhibitor减弱了沉默KCNQ1OT1对H/R诱导的H9c2细胞增殖的促进作用,以及对细胞凋亡的抑制作用;KCNQ1OT1靶向调控miR-384/CACNA1C轴。结论沉默KCNQ1OT1可能通过上调miR-384来抑制CACNA1C表达,进而促进H/R诱导的H9c2细胞增殖,抑制细胞凋亡。

SCN4A基因复合杂合变异导致先天性肌无力综合征1例

目的对1对具有3次不良孕产史的夫妇的临床资料以及先天性肌无力16型(CMS16)胎儿的遗传学特征进行分析。方法选取2018年2月因"2次不良孕产史"就诊于天津医科大学总医院的夫妇作为研究对象,回顾分析其临床资料。对其进行全外显子组测序(WES),并对候选变异进行Sanger测序验证。通过低深度全基因组测序对胎儿的染色体拷贝数变异(CNV)进行检测。结果孕妇第1胎孕27+5周晚期流产,超声检查发现胎儿胸水、羊水过多;第2胎孕30+5周超声检查发现胎儿手部畸形、胸水、羊水过多而选择引产。夫妻双方均否认遗传病家族史。孕妇第3胎CNV未见明显异常,SCN4A基因存在母源c.3172C>T(p.R1058W)和父源c.1431delG(p.K477fs*89)复合杂合变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)相关指南,判断c.3172C>T(p.R1058W)为可能致病性变异(PM1+PM2_Supporting+PP3+PP4),c.1431delG(p.K477fs*89)为致病性变异(PVS1+PM2_Supporting+PP4)。结论c.3172C>T(p.R1058W)和c.1431delG(p.K477fs*89)复合杂合变异考虑是孕妇第3个胎儿的致病原因,初步诊断其为CMS16。

钠离子通道β4亚基糖基化的初步研究

异常表达的糖蛋白与PD等多种神经退行性疾病有关。糖蛋白组学研究发现,电压门控钠离子通道β4亚基在PD病人脑组织中表达明显增加。为了深入探索β4亚基及其糖链在帕金森发生发展中的作用,采用PD转基因鼠对其表达进行验证,对其潜在的糖基化位点进行定点突变,构建重组表达质粒。结果发现,在新生PD转基因鼠和野生成鼠脑组织中有~38kDa蛋白条带表达,而在新生野生鼠脑组织中不表达;用PNGase F酶处理去除糖链后,~38kDa蛋白条带变成迁移速递更快的较小分子量条带,说明β4亚基是高度糖基化的蛋白,并且其糖基化与生长发育有关。将突变重组质粒转入HEK-293细胞和小鼠神经瘤细胞Neuro2A中表达,结果发现突变型质粒分子量明显低于野生型。为研究β4亚基及其糖链的功能提供了一定的实验数据并打下了基础。

SCN4B/β4在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的:探讨电压门控钠离子通道β4亚基(SCN4B/β4)在鼻咽癌组织中的表达,并分析其临床意义。方法:应用免疫组织化学ElivisionTM Plus法检测90例鼻咽癌病人鼻咽部活检标本和20份存档的石蜡包埋正常鼻咽黏膜组织(主要为鼻咽黏膜慢性炎)标本的SCN4B/β4表达情况,分析SCN4B/β4的阳性表达与鼻咽癌病人临床病理特征的关系。结果:鼻咽癌病人SCN4B/β4蛋白表达率低于正常鼻咽黏膜组织病人(P<0.01);SCN4B/β4蛋白表达在不同T分期、N分期、M分期、临床分期差异有统计学意义(P<0.05~P<0.01),T1~T2期、M0期、Ⅰ~Ⅱ期SCN4B/β4蛋白高表达率高于T3~T4分期、M1分期和Ⅲ~Ⅳ期,随N分期增加,SCN4B/β4蛋白高表达率下降;SCN4B/β4高表达5年生存率为85.2%,高于SCN4B/β4低表达的60.3%(P<0.05)。结论:鼻咽癌组织的SCN4B/β4蛋白高表达与淋巴结和远处转移呈负相关,SCN4B/β4高表达病人生存率较高。

SCN2B在APP/PS1小鼠脑组织中对APP加工处理的作用

目的在遗传背景为APP/PS1(APP/PS1+)的阿尔兹海默病模式基础上对SCN2B基因进行敲除(SCN2B-/-)、敲低(SCN2B+/-)或过表达(SCN2B+/+),构建APP/PS1+SCN2B-/-、APP/PS1+SCN2B+/-以及APP/PS1+SCN2B+/+三种品系转基因小鼠,探究SCN2B在APP加工处理及Aβ产生过程中的可能作用。方法将阿尔兹海默病模式动物APP/PS1+小鼠分别与SCN2B-/-、SCN2B+/-及SCN2B+/+三种转基因小鼠杂交并获得稳定转基因品系。运用PCR技术检测品系小鼠基因型,qRT-PCR、Western blot检测SCN2B基因在各品系小鼠脑中的表达量。挑选出适龄转基因阳性小鼠获取脑皮质与海马组织进行神经元代培养,ELISA检测神经元中的Aβ40和Aβ42在脑皮质海马中的表达含量,Western blot检测APP-APPβ-CTF、sAPPα、sAPPβ蛋白含量。结果与APP/PS1+SCN2B-/-、APP/PS1+SCN2B+/-两组相比,APP/PS1+SCN2B+/+组中Aβ40和Aβ42蛋白表达增加(P<0.05);sAPPα,sAPPβ蛋白表达随SCN2B蛋白的表达升高而减少(P<0.05);而APP-APPβ-CTF与AICD的蛋白表达随SCN2B蛋白的表达升高而增加(P<0.05)。结论SCN2B基因过表达能促进APP向产生Aβ40和Aβ42片段的分解过程;促进APP分解为致病性的APP-APPβ-CTF及AICD,减少其向水溶性可代谢的sAPPα片段分解,进而部分阐明SCN2B在APP加工处理及Aβ产生中的作用。