人肾高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白基因的克隆和生物信息学分析

为探讨人高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白 (humanhigh affinitysodium dependentdicar boxylatetransporter,hSDCT2orhNaDC3 )基因在人体内的生理功能及其与疾病的关系 ,借助生物信息学成功地从人肾中克隆了hSDCT2基因 (GenBank接收号 :AY0 72 810 ) .首先将大鼠SDCT2cDNA与人EST数据库进行同源性比较 ,获得具有高度同源性EST片段并用DNAstar软件将它们拼接成EST重叠群 .在重叠群上设计PCR引物从人肾总RNA中用RT PCR扩增出hSDCT2基因并测序 ,然后用软件对其结构特性、组织分布及基因定位进行分析 .序列测定结果显示 ,hSDCT2开放阅读框为180 9bp ,共编码 6 0 2个氨基酸 .蛋白同源性分析表明 ,其氨基酸序列与大鼠及小鼠SDCT2分别有85 %和 87%相同 .二级结构分析显示 ,该蛋白有 12个跨膜螺旋区 .Northern分析显示 ,该基因可在肾、肝、脑、胎盘等多种组织中表达 ,并定位于 2 0号染色体的q12～q13

高亲和力钠离子依赖二羧酸转运蛋白基因的克隆、表达及亚细胞定位研究

为了研究高亲和力钠离子依赖二羧酸转运蛋白(high affinity sodium-dependent dicarboxylate trans-porter,SDCT2,NaDC3)的功能,从小鼠肾组织中克隆出了其cDNA基因,并对其结构特征、基因表达谱及细胞内定位情况进行了分析。结果显示NaDC3蛋白由600个氨基酸组成,同源性分析表明其氨基酸序列与大鼠及人NaDC3分别有97％和87％相同。二级结构分析显示,该蛋白有13个跨膜α-螺旋区。Northern杂交显示该基因可在肾、肝、脑、胎盘等多种组织中表达。激光共聚焦显微镜观察显示该蛋白定位于肾小管上皮细胞膜上。

人钠依赖性二羧酸转运蛋白2(hSDCT2)的组织表达谱分析

利用DNA重组技术 ,构建重组表达质粒pGEX hSDCT2 .IPTG诱导其表达后 ,采用谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,获得纯化的谷胱甘肽S 转移酶 (GST) hSDCT2重组融合蛋白 .以此为免疫原免疫兔制备GST hSDCT2融合蛋白抗体 .多组织Northern印迹法结果显示 ,3 6kb的hSDCT2基因转录产物 ,在心、骨骼肌、胸腺、小肠、肺和外周血白细胞等组织中几乎不表达 ,在脑、结肠、脾、肝和胎盘中仅有少量表达 ,但在肾脏中大量表达 ;并且在肾脏和脾脏中还存在着另一种约 4 3kb的转录产物 .Western印迹法证实 ,hSDCT2蛋白以类似方式于上述组织表达 .免疫组化双重染色结果发现 ,与分布于近端肾小管刷状缘的hSDCT1不同 ,hSDCT2主要分布于近端肾小管的基底膜侧 .这些结果为进一步研究人钠依赖性二羧酸转运蛋白 2的结构和功能奠定了基础 .

人钠/二羧酸协同转运蛋白1基因融合表达及其抗体制备

利用DNA重组技术 ,将编码人钠 羧酸协同转运蛋白 1(hNaDC1)抗原表位区 (W138 Q2 19)的cDNA克隆至融合表达载体pGEX 5X 1,构建重组质粒pGEX hNaDCL6 .在大肠杆菌BL2 1中 ,经IPTG诱导 ,获得谷胱甘肽巯基转移酶 (GST) hNaDC1重组融合蛋白的表达 .以谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,获得纯化的GST hNaDC1.以此为免疫原制备的抗hNaDC1抗体可特异性识别人类和大鼠肾组织以及小肠组织中天然的钠 二羧酸协同转运蛋白 1.利用该抗体 ,首次证实了hNaDC1基因编码产物分布于人肾组织近端肾小管刷状缘 ,与大鼠钠 二羧酸协同转运蛋白 1(SDCT1)分布一致 .

钠依赖二羧酸转运蛋白3和葡萄糖对肾小管上皮细胞琥珀酸转运的影响

目的 探讨钠离子依赖的二羧酸转运蛋白 3(NaDC3)对细胞能量代谢的作用以及NaDC3不同表达和不同葡萄糖浓度对肾小管上皮细胞琥珀酸转运的影响。方法 应用Westernblot明确正义转染、反义转染、空质粒转染 (pcDNA3)及未转染的人近曲肾小管上皮细胞 (HKC)中细胞hNaDC3蛋白表达的差异 ,用毛细管电泳技术测定不同时间点或同一时间不同葡萄糖浓度时细胞摄取缓冲液中琥珀酸的量。结果 正义转染细胞hNaDC3蛋白表达增强 ,约是未转染HKC细胞的 1 5倍 ,缓冲液中琥珀酸含量下降较快 ,琥珀酸摄取增快。反义转染细胞hNaDC3蛋白表达下降 ,约是未转染HKC细胞的 2 / 3,但两者缓冲液中琥珀酸含量下降差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。空质粒转染对hNaDC3蛋白表达和琥珀酸摄取无明显影响。随葡萄糖浓度增加 ,缓冲液中琥珀酸含量下降增快。结论 hNaDC3蛋白过表达可加速三羧酸循环中间代谢产物的转运 。

钠/二羧酸转运蛋白研究进展

钠 /二羧酸转运蛋白 (NaDCs)是一类负责转运枸橼酸、琥珀酸及α 酮酸等三羧酸循环中间产物的跨膜有机阴离子转运蛋白。分布于小肠、肾脏、肝脏、肾上腺、脑、肺及胎盘等组织。它不仅参与能量代谢、酸碱平衡调节 ,而与氨基酸及糖皮质激素的合成也有密切关系 ,新近研究发现它可能还是调控哺乳类寿限的重要基因之一。

钠离子依赖性中性氨基酸转运载体2特性、表达调控及功能

转运系统A载体——钠离子依赖性的中性氨基酸转运载体2(SNAT2)是近年发现的氨基酸转运感受体的典型代表,是体内主要的氮转运载体。SNAT2通过转运过程调节细胞内氨基酸浓度,进而调控细胞内氨基酸感受体的下游信号,发挥氨基酸转运载体和信号受体的双重功能,而成为近年氨基酸营养感应的研究热点。本文围绕SNAT2的分子特性、生物学特性、表达调控及其介导的氨基酸感应信号的研究进展进行综述。

钠离子牛磺胆酸共转运多肽缺陷病及其对母胎影响的研究进展

钠离子牛磺胆酸共转运多肽(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)缺陷病是一种溶质载体家族10成员1(solute carrier family 10 member 1,SLC10A1)双等位基因突变引起的胆汁酸代谢障碍性疾病,分布具有区域和种族差异,其中SLC10A1 c.800C>T(p.Ser267Phe)是我国的高频突变。NTCP缺陷病患儿主要表现为病理性黄疸,少部分有生长、运动和神经系统发育迟缓的表现,成年患者临床症状和体征不明显,生化检查提示血清总胆汁酸水平升高、部分伴有转氨酶和25-羟维生素D3水平降低。NTCP缺陷病性高胆汁酸血症需与乙型肝炎病毒感染、丁型肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎及妊娠期肝内胆汁淤积症等鉴别,妊娠合并NTCP缺陷病性高胆汁酸血症对母胎的影响迄今少有相关报道。综述NTCP缺陷病的分子遗传机制、临床表现、实验室检查、诊断、治疗及其对母胎的影响,为该病患者的明确诊断和正确干预提供依据。

人钠/二羧酸协同转运蛋白3基因调控肾小管上皮细胞线粒体膜电位的研究

目的 观察人钠/二羧酸协同转运蛋白3(hNaDC3)对人肾脏近曲小管上皮细胞(HKC)线粒体膜电位的变化及其对细胞能量代谢的影响。方法 应用亚克隆技术构建正义pcDNA3-hNaDC3和反义pcDNA3-AhNaDC3两个真核表达载体,通过脂质体LipofectAMINE将pcDNA3-hNaDC3及pcDNA3-AhNaDC3转染至HKC细胞。克隆筛选后,用RT-PCR、Northern印迹及Western印迹鉴定外源基因的整合和表达。荧光探针JC-1观察各细胞系线粒体膜电位的变化。结果 外源hNaDC3基因稳定整合到HKC细胞基因组中,并获得高、低表达。转染正义hNaDC3 cDNA的HKC细胞线粒体膜电位降低,JC-1在线粒体内形成单体,发出绿色荧光;而转染反义hNaDC3 cDNA的HKC细胞线粒体膜电位略微升高,JC-1形成聚合体,发出红色荧光。结论 hNaDC3过表达引起线粒体膜电位降低,反义hNaDC3则使线粒体膜电位略微升高。提示NaDC3可能通过使线粒体膜电位下降,参与了细胞能量代谢。

大鼠低亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白对枸橼酸及草酸转运电生理特性的研究

目的 探讨大鼠低亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白(SDCT1)对枸橼酸及草酸的转 运特点。方法 克隆出大鼠SDCT1全长cDNA基因。应用爪蟾卵母细胞异源性表达SDCT1,并 使用双电极电压钳法记录通道电流。通过改变灌流液中枸橼酸、草酸的浓度,以及两种底物转运 时钠离子的浓度及pH值,对其特性进行了研究。结果SDCT1对枸橼酸及草酸的转运均为底 物浓度及钠离子依赖。pH值变化显著影响2者的转运。但低pH对草酸的转运影响要远大于枸 橼酸。结论 在临床实践中,虽然升高尿液pH值可以抑制枸橼酸的重吸收,发挥其抑制钙盐沉 积的功能。但过度地碱化尿液也会使草酸的重吸收受到抑制,使草酸大量存留在尿中而导致结 石。保持适当的尿酸碱度是必要的。

钠离子转运相关基因多态与原发性高血压的相关性研究

目的研究α-内收蛋白（alpha—adducin，ADD1）基因的rs4961位点和钠钾泵ATP酶α2亚基（Na^＋／K^＋ATPasea2，ATP1A2）基因的rs28933400位点与原发性高血压的相关性。方法选取原发性高血压患者196例，健康体检者192名，应用突变分离PCR法检测位点rs4961和rs28933400的多态性。结果rs4961位点的基因型和等位基因频率在病例组与对照组差异有统计学意义（P=0．03、P=0．04）；rs4961的基因型对收缩压、舒张压和Na^＋浓度的影响差异有统计学意义（P=0．00、P=0．04、P=0．01），对体重指数、K^＋浓度和Cl^-浓度变化的影响差异无统计学意义（P〉0．05）；rs28933400位点在该人群中缺乏多态性。结论ATPIA2基因的rs28933400位点在该人群中可能与原发性高血压无关，而ADD1基因的rs4961位点在该人群中则可能与原发性高血压有关。

膜通道的分子学多样性、疾病基因（4）

膜通道有离子通道和水通道,前者又包括钙通道(电压依赖性、对钙离子选择性通过的细胞膜糖蛋白)、钠通道、钾通道、氯通道等.其中钙通道又分为L、T、N、P、Q和R型前两者存在于心血管系统和中枢神经系统,后四者存在于神经元组织中.美国的两位科学家因为在离子通道和水通道结构方面的杰出成就获得了2003年诺贝尔化学奖,关于膜通道的研究和发现对于我们在分子水平理解离子和水的转动机制至关重要,进而对于理解基本生物过程和相关疾病的分子基础、以及将来可能的治疗方法的结构基础都有重要意义.

大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E中VDR、PKC及其相互作用对Na DC1表达的影响

目的:探究大鼠肾小管上皮细胞NRE-52E中蛋白激酶C(PKC)、维生素D受体(VDR)及其相互作用对钠离子依赖性二羧酸协同转运蛋白1(Na DC1)表达的影响。方法:体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRE-52E,采用PKC激动剂和PKC抑制剂干预NRE-52E细胞,并用VDR过表达载体及VDR-shRNA载体转染NRE-52E细胞,结合Western blot检测细胞中PKC、VDR和Na DC1的蛋白表达情况。结果:成功建立VDR稳定过表达和VDR稳定干扰的NRK-52E细胞株。与对照组比较,PKC激动剂组VDR和Na DC1蛋白表达量显著上调(P <0. 01),VDR过表达组的PKC和Na DC1蛋白表达量显著上升(P <0. 01),VDR干扰+PKC激动剂组和VDR过表达+PKC抑制剂组中PKC和Na DC1蛋白的表达水平均介于VDR干扰组与VDR过表达组之间。结论:在大鼠肾小管上皮细胞NRE-52E中PKC活性增强诱导VDR蛋白表达,PKC活性减弱抑制Na DC1蛋白表达;VDR与PKC和Na DC1的蛋白表达存在明显正相关;PKC与VDR相互作用时PKC高活性和VDR过表达是促进或维持Na DC1蛋白表达的主要因素。

HBV感染的实验诊断进展及其个体化诊疗

有关HBV的研究取得了一系列重要进展:HBV侵入肝细胞的受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)的发现;HBV感染及其结局的分子遗传学机制逐步得以阐明;借助自动化检测设备,临床实验室检测HBV血清标志物的能力大大提高。得益于以上基础和临床研究,在个体化医学时代背景下,一是应该厘清血清学检验的实验室检测路径,进一步明确新老血清标志物的诊断价值;二是应该结合HBV基因检测和宿主基因检测,开发新的检验项目,以预测HBV感染的转归和结局,预测CHB患者IFN-α或核苷(酸)类似物治疗的疗效。

雌激素受体α对胆汁酸转运相关基因的调控及其与孕鼠肝内胆汁淤积症发生的相关性

目的探讨雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)对参与调节胆汁酸转运相关的基因,如法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)、钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate co-transprorting polypeptide,NTCP)、胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)的调控作用及其对孕鼠肝内胆汁淤积发生的影响。方法将40只SPF级SD孕鼠随机均分为4组。自孕第15 d起,对照组颈部皮下注射精制植物油2.0 m L/kg·d;低、中、高剂量组分别皮下注射17α-乙炔雌二醇1.0 mg/kg·d、1.25 mg/kg·d、1.5 mg/kg·d。于妊娠第21 d采血2 m L,后采用颈部脱臼法处死,提取母鼠肝脏行活体组织学检查。检测各组孕鼠血清中的生化指标及肝脏组织中各目的蛋白和mRNA表达量。结果生化指标:低、中、高剂量组孕鼠各蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),低、中、高剂量组组间比较,差异有统计学意义(P<0.05);蛋白表达及mRNA的表达水平:ER在对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的表达量依次升高,而FXR、NTCP、BSEP在对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的表达量依次降低,各组目的基因表达量与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论随着雌激素剂量的增加,ERα表达水平升高,而FXR、NTCP、BSEP表达水平均降低,提示胆汁酸代谢转运功能降低,可能为雌激素诱导孕鼠肝内胆汁淤积的发生机制之一。