胃癌组织ATP1 A2的表达及机制探讨

目的观察胃癌组织ATP酶α2亚基(ATP1A2)表达情况,探讨其与黏着斑通路、细胞黏附分子、钙离子通路、细胞外基质相关信号通路的关系。方法从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载并预处理胃癌RNASeq V2数据、从人类肿瘤相关基因表达汇编(GEO)数据库下载胃癌样本数据集GSE62254的series matrix数据,通过TCGA数据集纳入胃癌患者293例,通过GEO数据集纳入胃癌患者300例。根据表达谱数据,将胃癌组织ATP1A2表达由低到高排序,按33%、67%者将数据三等分,低于33%者为低表达,高于67%者为高表达,两者之间为中表达。分析不同ATP1A2表达与胃癌患者临床病理参数的关系,比较低、中、高表达者中位生存时间,利用基因集富集分析方法预测ATP1A2相关的基因通路。结果 TCGA数据集纳入的293例胃癌患者中,ATP1A2低、中、高表达者分别为95、99、99例;不同ATP1A2表达与胃癌患者性别、年龄无关(P均>0.05),与T分期、N分期、p TNM分期及组织分化程度有关(P均<0.05);ATP1A2低、中、高表达者中位生存时间分别为70、36.9和26个月,三者间比较P<0.01。GEO数据集纳入的300例胃癌患者中,ATP1A2低、中、高表达者分别为99、102、99例;不同ATP1A2表达与胃癌患者性别、年龄、T分期、N分期、p TNM分期及Lauren分型均有关(P均<0.05);ATP1A2高表达者的中位生存时间为31个月,较低表达和中表达者中位生存时间明显延长(P<0.01)。ATP1A2高表达富集了黏着斑通路、细胞黏附分子、钙离子信号通路、细胞外基质等相关的基因通路(P<0.05或<0.01)。结论胃癌组织中ATP1A2高表达,其高表达预示患者预后不良;ATP1A2高表达导致黏着斑通路、细胞黏附分子、钙离子信号通路、细胞外基质等基因通路异常可能是其作用机制。

达格列净通过改善线粒体功能减轻2型糖尿病小鼠及高糖诱导的血管内皮细胞损伤

目的:探讨达格列净对2型糖尿病小鼠胸主动脉内皮细胞损伤及高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的抑制作用及其分子机制。方法:(1)将20只2型糖尿病db/db小鼠随机分为模型组和达格列净组,另取10只正常db/m小鼠作为对照组。饲养40 d后麻醉处死,迅速摘取眼球取血,分离血清,并收集胸主动脉组织。HE染色观察胸主动脉组织形态学改变,Western blot法检测小鼠胸主动脉组织中ATP合酶α亚基(ATP5A1)、内皮素1(ET-1)和前列环素(PGI_(2))蛋白表达水平。(2)将HUVECs分为对照组、DMSO组、高糖组和高糖+达格列净组;采用活性氧(ROS)荧光探针和线粒体ATP荧光探针检测HUVECs中ROS及线粒体ATP荧光强度;采用免疫细胞化学和Western blot检测HUVECs中ATP5A1、ET-1和PGI_(2)蛋白表达水平。结果:达格列净可显著减轻db/db小鼠胸主动脉组织损伤;与高糖组相比,达格列净治疗后HUVECs中ROS荧光强度显著降低,线粒体ATP荧光强度显著升高(均P<0.01);免疫细胞化学和Western blot结果显示,达格列净治疗后ATP5A1和PGI_(2)蛋白表达水平显著升高,ET-1蛋白表达水平显著降低(均P<0.01);ATP5A1过表达质粒转染后,HUVECs中ATP5A1和PGI_(2)蛋白表达水平显著升高,ET-1表达水平显著降低(均P<0.01)。结论:达格列净减轻2型糖尿病小鼠胸主动脉内皮细胞损伤及高糖诱导的HUVECs损伤,其机制可能与调控ATP5A1表达、改善线粒体功能有关。

猪传染性胃肠炎病毒Nsp2与宿主细胞蛋白PSMD11相互作用的研究

为确定猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)与宿主细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11(PSMD11)之间是否存在相互作用,本研究利用RT-PCR方法扩增猪源PSMD11基因,并构建其真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11,经测序和双酶切验证正确后,转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11是否能在IPEC-J2中表达。利用免疫共沉淀(Co-IP)试验检测TGEV Nsp2和宿主细胞PSMD11蛋白之间的相互作用,并通过激光共聚焦显微镜观察TGEV Nsp2与PSMD11在宿主细胞中的共定位情况。结果显示,本研究成功扩增了猪源PSMD11基因,大小约为1474 bp,基因序列经测序比对与标准序列完全一致。构建的真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11能在IPEC-J2细胞中成功表达PSMD11蛋白;Co-IP结果表明,PSMD11与Nsp2之间存在相互作用;共定位试验结果显示,PSMD11与Nsp2的相互作用发生在细胞质中,且细胞中PSMD11蛋白的表达位置并未因Nsp2的表达而发生改变。本研究结果为进一步研究TGEV Nsp2在病毒感染过程中所发挥的重要作用提供新的线索。

棉铃虫ATP合酶亚基α对Cry2Ab毒理的影响

为探究棉铃虫Helicoverpa armigera ATP合酶亚基α(ATP synthase subunitα,ATPs-α)对Cry2Ab毒理的影响,采用实时荧光定量PCR技术检测了ATPs-α基因在棉铃虫幼虫不同发育阶段、不同组织及受Cry2Ab诱导后的表达量,并通过在昆虫细胞中过表达和干扰ATPs-α基因验证其在Cry2Ab毒理中的功能。结果显示:ATPs-α基因在棉铃虫各发育阶段和组织中普遍表达,其中在幼虫的1龄和2龄期,以及5龄的中肠、头部和表皮中表达较高。棉铃虫取食Cry2Ab 6 h后,ATPs-α基因表达量开始显著降低,一直持续到36 h;在Sf9细胞系中成功表达ATPs-α蛋白后,显著增强了Cry2Ab的细胞毒力;在美洲棉铃虫H.zea的中肠细胞中干扰ATPs-α基因后,显著降低了Cry2Ab的细胞毒力。表明棉铃虫ATPs-α参与Cry2Ab的毒理过程。

胃癌组织中a2V表达及与M2型巨噬细胞的相关性

目的探讨液泡膜-ATP酶a2亚基（a2V）在胃癌组织中的表达,及其与M2型巨噬细胞水平的相关性,并探讨a2V表达与胃癌生物学行为的关系。方法应用免疫组化方法检测胃癌组织和癌旁组织中a2V的表达,以CD163标记M2型巨噬细胞,检测其在胃癌组织中的水平,结合病人的临床病理资料分析两者的相关性及a2V与胃癌生物学行为的关系。结果胃癌组织中a2V的阳性表达率高于对应的癌旁正常组织（χ~2=9.751,P〈0.05）。胃癌组织中a2V表达与CD163水平呈正相关（r=0.360,P〈0.05）。a2V的表达与胃癌组织TNM分期、淋巴结转移有关（χ~2=7.581、6.289,P〈0.05）。a2V低表达胃癌病人的生存情况优于高表达病人（χ~2=4.604,P〈0.05）。结论 a2V在胃癌组织中表达上调,与胃癌的侵袭和转移及M2型巨噬细胞的水平有关,a2V蛋白高表达病人的预后不良。

液泡膜ATP酶亚基的N末端结构域与巨噬细胞集落刺激因子协同极化巨噬细胞影响胃癌细胞的增殖能力

目的探讨液泡膜ATP酶亚基的N末端结构域（a2NTD）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）对巨噬细胞极化的协同作用，以及极化的巨噬细胞对胃癌细胞增殖能力的影响。 方法分离健康人外周血单个核细胞，诱导培养巨噬细胞后分为4组：对照组（RPMI1640），实验Ⅰ组（M-CSF 100 ng/ml），实验Ⅱ组（a2NTD 500 ng/ml）和实验Ⅲ组（a2NTD 500 ng/ml加M-CSF 100 ng/ml），刺激48 h后应用双重免疫荧光标记法检测巨噬细胞膜表面抗原的表达，用ELISA法检测细胞因子IL-10和IL-12的分泌情况，并用CCK-8法检测巨噬细胞对胃癌SGC-7901细胞增殖能力的影响。 结果巨噬细胞膜表面抗原CD68在4组巨噬细胞膜上均有表达（＋），平均吸光度值（MD值）分别为：对照组0.092±0.005，实验Ⅰ组0.095±0.006，实验Ⅱ组0.094±0.005，实验Ⅲ组0.094±0.005 ，4组比较，差异无统计学意义（P〉 0.05）。CD206在对照组弱表达（-），MD值为0.025±0.004；在实验Ⅰ组和实验Ⅱ组均有表达（＋），MD值分别为0.191±0.012和0.197±0.136，在实验Ⅲ组超强表达（＋＋＋），MD值为0.285±0.011；除实验Ⅰ组与实验Ⅱ组比较差异无统计学意义（P〉 0.05），其余各组两两比较，差异均有统计学意义（均P〈 0.01）。实验Ⅰ组和实验Ⅱ组细胞分泌IL-10水平分别为（85.65±13.64） ng/L和（87.77±14.25）ng/L，均高于对照组[（71.67±7.56）ng/L，P 〈 0.01] ；分泌IL-12水平分别为（9.91±1.50）ng/L和（10.15±1.80）ng/L，均低于对照组[（16.87±1.10）ng/L，P〈 0.01]。实验Ⅲ组分泌IL-10水平为（116.98±14.27）ng/L，高于其余各组（均P〈 0.01）；分泌IL-12水平为（5.31±0.88）ng/L，低于其余各组（均P〈 0.01）。析因分析显示，在对IL-10和IL-12分泌量的影响上，a2NTD和M-CSF具有交互效应（均P 〈0.05）。各组巨噬细胞均能加快胃癌SGC-7901细胞的增殖，且实验Ⅲ组巨噬细胞对胃癌SGC-7901细胞增殖速度的促进作用明显强于其他各组（均P〈 0.01）。 结论a2NTD与M-CSF在促使巨噬细胞极化及细胞因子分泌上具有协同作用，协同极化的巨噬细胞能明显增强胃癌细胞增殖能力。

低氧训练对骨骼肌p53及其调控的线粒体有氧代谢信号通路基因表达的影响

目的:探讨低氧训练对大鼠骨骼肌p53及其调控的线粒体有氧代谢信号通路基因表达的影响,以及对线粒体有氧氧化供能能力的影响。方法:30只雄性Wistar大鼠随机分为3组(n=10),低住低练组(LoLo)、高住高练组(HiHi)和高住高练低训组(HiHiLo)。以当地海拔1500 m为常氧环境,模拟海拔3500 m为低氧环境,各组大鼠按训练方案训练5周后,取股四头肌行匀浆及提取线粒体。Real-time PCR检测p53、细胞色素c氧化酶合成2(SCO2),细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)和谷氨酰胺酶2(GLS2)mRNA表达,Westem blot检测p53、SCO2、COXⅠ和GLS2蛋白表达;ELISA测定α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDHC),细胞色素c氧化酶(COX)及ATP合酶(ATP synthase)活性。结果:①与LoLo组比较,HiHi和HiHiLo组p53 mRNA水平显著升高(P<0.01),HiHiLo组p53蛋白表达水平显著下降(P<0.01);HiHi和HiHiLo组SCO2 mRNA水平和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);HiHiLo组COXⅠmRNA水平显著升高(P<0.01),HiHi组显著降低(P<0.01),HiHi组COXⅠ蛋白表达水平显著升高(P<0.05);HiHi和HiHiLo组GLS2 mRNA水平均显著升高(P<0.05,P<0.01),HiHiLo组GLS2蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。②与LoLo组比较,HiHi组ɑ-KGDHC和COX活性均显著降低(P<0.01,P<0.05),HiHiLo组均显著升高(P<0.01);HiHi和HiHiLo组ATP synthase总活性和特异性活性均显著升高(P<0.01)。结论:高住高练低训上调大鼠骨骼肌p53及其调控的线粒体有氧代谢信号通路相关因子基因转录水平,提高骨骼肌线粒体有氧氧化供能能力。

基于多重生物信息整合的类风湿关节炎寒湿痹阻证新型生物标志物的识别与验证

通过整合基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)、加权基因共表达网络分析(weighted gene correlation network analysis,WGCNA)与临床独立样本集验证,识别类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)寒湿痹阻证的新型生物标志物。首先收集临床诊断为RA寒湿痹阻证患者、RA非寒湿痹阻证患者与健康志愿者的全血样本,开展转录组测序。以RA非寒湿痹阻证患者与健康志愿者作为对照,筛选RA寒湿痹阻证的差异表达基因集;进而,开展GSEA和WGCNA的整合挖掘,获取关键差异表达基因作为该病证的候选生物标志物。再利用临床独立验证样本(每组≥10例)对上述病证候选生物标志物的表达水平进行实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)验证,采用受试者工作特征(receiver operator characteristics,ROC)曲线等评价其辨证效能。研究结果显示,与健康对照组相比,获得3601个RA寒湿痹阻证相关差异表达基因(包含106个上调表达基因和3495个下调表达基因),其最显著富集于“免疫-炎症”调节、激素调节、物质和能量代谢相关通路,其次是细胞功能调控和滑膜血管翳生成相关通路等。并通过GSEA和WGCNA表明,变异系数、作用通路和生物模块代表性均排名前50%的关键差异基因ATP酶蛋白酶26S亚基2(proteasome 26S subunit,ATPase 2,PSMC2)为RA寒湿痹阻证的候选生物标志物。进一步,利用临床独立样本集的验证结果显示,PSMC2针对RA寒湿痹阻证的辨证效能参数——F1检测值、特异度、准确度、精确度分别为70.3%、61.9%、64.5%、81.3%,ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.96。综上,该研究应用“GSEA-WGCNA-验证”整合策略,识别出PSMC2为RA寒湿痹阻证的新型候选生物标志物之一,有助于提高RA核心证候的中医临床诊疗水平和辨证客观化水平。

钠离子转运相关基因多态与原发性高血压的相关性研究

目的研究α-内收蛋白（alpha—adducin，ADD1）基因的rs4961位点和钠钾泵ATP酶α2亚基（Na^＋／K^＋ATPasea2，ATP1A2）基因的rs28933400位点与原发性高血压的相关性。方法选取原发性高血压患者196例，健康体检者192名，应用突变分离PCR法检测位点rs4961和rs28933400的多态性。结果rs4961位点的基因型和等位基因频率在病例组与对照组差异有统计学意义（P=0．03、P=0．04）；rs4961的基因型对收缩压、舒张压和Na^＋浓度的影响差异有统计学意义（P=0．00、P=0．04、P=0．01），对体重指数、K^＋浓度和Cl^-浓度变化的影响差异无统计学意义（P〉0．05）；rs28933400位点在该人群中缺乏多态性。结论ATPIA2基因的rs28933400位点在该人群中可能与原发性高血压无关，而ADD1基因的rs4961位点在该人群中则可能与原发性高血压有关。