Na^+-K^+-ATP酶α1亚基DR多肽单克隆抗体的制备和应用

目的制备钠钾ATP酶(Na^+-K^+-ATPase)α1亚基DR区段(897DVEDSYGQQWTYEQR911)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其活性。方法以合成的DR-钥孔戚血蓝素(KLH)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗DR的杂交瘤细胞株,制备Na^+-K^+-ATPaseα1亚基DR mAb。ELISA测定杂交瘤细胞上清中mAb效价,斑点免疫杂交、Western blot法及免疫荧光细胞化学染色法检测单克隆的特异性,采用Senso LyteFDP蛋白磷酸酶定量试剂盒检测Na^+-K^+-ATPase活性,高糖细胞损伤实验检测DR mAb对高糖引起细胞损伤的保护作用。结果成功制备3株稳定分泌抗体的阳性细胞株。选择强阳性DRm217细胞株,制备腹水进一步验证。免疫荧光细胞化学染色、免疫斑点杂交及Western blot法结果显示,DRm217 mAb能够特异性结合在细胞膜表面,识别Na^+-K^+-ATPase的DR多肽。DRm217能够提高Na^+-K^+-ATPase活性,对高糖引起的细胞损伤具有一定的保护作用。结论成功制备了针对Na^+-K^+-ATPase DR多肽的mAb。

Na-K-2Cl联合转运子-1和α_2 Na,K-ATP酶在耳蜗钾离子循环中的作用及与听觉功能的关系

目的应用 Na-K-2Cl 联合转运子-1(Na-K-2Cl Co-transporter 1,NKCC1)^(-/-)、NKCC1^(+/-)、α_2,Na,K-ATP 酶^(+/-)和 NKCC1^(+/-)/α_2Na,K-ATP 酶^(+/-)等不同基因型小鼠作为实验平台,对耳蜗钾离子循环模式与听觉功能进行研究,检验 NKCC1 和α_2Na,K-ATPase 在耳蜗钾循环中的地位和作用。方法应用 NKCC1^(-/-)、NKCC1^(+/-)和α_2Na,K-ATPase^(+/-)等基因敲除和转基因小鼠,同时培育 NKCC1^(+/-)/α_2Na,K-ATPase^(+/-)双半拷贝基因小鼠,采用听性脑干反应和耳蜗内电位检测技术对小鼠的听觉功能进行检测。应用 NKCC1 通道阻断剂速尿和 Na,K-ATP 酶通道阻断剂哇巴因,对 Castel鼠系进行通道阻断-听觉功能实验,进一步在小鼠体内检测耳蜗钾循环模式,对内耳钾循环与听觉生理之间的关系进行印证。结果 NKCC1^(+/-)小鼠和α_2Na,K-ATP 酶^(+/-)小鼠的听性脑干反应短声阈值(声压级)分别为(38.49±12.29)dB 和(53.32±7.62)dB,与野生型小鼠的(23.13±3.78)dB 比较均有提高,差异有统计学意义(t 值分别为3.559和10.267,P<0.05)。NKCC1^(+/-)小鼠和α_2Na,K-ATP 酶^(+/-)小鼠的耳蜗内电位值分别(78±7)mV 和(71±14)mV,分别低于野生型小鼠的(98±16)mV。NKCC1^(+/-)/α_2Na,K-ATP 酶^(+/-)小鼠听性脑干反应短声阈值为(24.14±8.83)dB,低于α_2Na,K-ATPase^(+/-)小鼠和 NKCC1^(+/-)小鼠,差异有统计学意义(t 值分别为6.128和2.255,P<0.05)。注射速尿后的 Castel 小鼠听性脑于反应听阈明显升高,与注射前比较其差异有统计学意义(t=12.162,P<0.05);注射哇巴因后的 Castel 小鼠也出现听阈升高(t=7.644,P<0.05)。而次序注射哇巴因和速尿后,Castel 小鼠听性脑干反应听阈明显低于单独注射速尿(t=4.515,P<0.01)。结论 NKCC1和α_2,Na,K-ATP 酶是耳蜗钾循环中的关键通道,任何一通道蛋白出现功能失衡均可影响内淋巴钾离子浓度及耳蜗内电位的维持,进而影响听觉功能。NKCC1 和α_2Na,K-ATP 酶在耳蜗钾循环诸通道中处于一种限制性动态平衡关系,在内耳钾代谢和耳蜗听觉功能的发挥中具有重要意义。本实验在小鼠实体中验证了 NKCC1和α_2Na,K-ATP 酶在内耳钾循环径路中的重要作用,同时也模拟了内耳钾循环模式。

饲料中钾对皱纹盘鲍幼鲍生长及其生理指标的影响

在以酪蛋白和明胶为蛋白源的半精制基础饲料中,添加不同浓度梯度的钾(0、2、4、8、16、32 g钾/kg饲料),钾源为KCl,配制成6种实验饲料(实测钾含量分别为:0.10、2.12、4.39、9.79、20.08和27.26 g/kg),探讨皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)幼鲍对饲料中钾的需求量及其在长期适应不同含量钾的过程中的生理反应。幼鲍初始体重为(0.24±0.00)g,初始壳长为(12.24±0.04)mm,实验在流水系统中进行,养殖周期为15周。实验期间水温12—23℃,海水钾含量为(472.94±3.59)mg/L。结果表明,饲料中不同含量的钾对皱纹盘鲍的增重率(WGR,%)、贝壳日增长(DISL,μm/d)及存活率没有显著影响(P>0.05)。皱纹盘鲍软体部的水分、粗脂肪和贝壳的灰分含量受饲料中钾含量的影响不显著(P>0.05)。当饲料中钾含量大于等于4.39 g/kg时,与0.10 g/kg饲料组相比,软体部粗蛋白质含量显著升高(P<0.05)。软体部钾的含量和贝壳中钾、钠的含量受饲料中钾含量的影响不显著(P>0.05)。幼鲍软体部钠含量在饲料钾含量为20.08、27.26 g/kg时显著低于其他各组(P<0.05)。鳃Na+-K+ATP酶活力随着饲料中钾含量的增加逐渐下降,当饲料中钾含量为20.08、27.26g/kg时,与0.10 g/kg组相比显著降低(P<0.05),但与其他组相比差异不显著。因此研究认为:以生长指标为判据,不需要在饲料中补充钾,海水中钾和饲料原料中的钾能够维持皱纹盘鲍幼鲍的正常生长;但以生理指标(软体部粗蛋白质和钠含量,鳃Na+-K+ATP酶活力)评判,饲料中钾的适宜含量为2.12 g/kg。

特布他林对海水浸泡人肺泡上皮细胞钠钾泵及钠通道的影响

目的探讨特布他林对海水浸泡的人肺泡上皮细胞（A549）钠水转运通道的影响。方法将常规培养的A549细胞分为海水处理（SG）组、特布他林（20txmol／L孵育6h）处理（TG）组和阴性对照（NG）组。采用甲基噻唑基四唑（MTY）法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞的凋亡和坏死情况，Westernblotting法检测钠钾泵仪1亚单位（Na＋／K＋-adenosinetriphosphatase—cd，NKA—od）、钠通道d亚单位（epithelailsodiumchannds—d，a-ENaC）的表达，水解比色法检测Na＋-K＋-ATP酶（Na-／K＋-exchangingATPase，NKA）活性。结果MTI＂法及流式细胞仪检测结果均显示，特布他林处理对海水孵育后细胞的存活率无影响。NG组的NKA—al和仅-ENaC蛋白表达显著高于SG组（P〈0．01）和TG组（t=3．71，3．78，P〈0．01），TG组显著高于SG组（t=2．58，2．64；P〈0．05）。与NG组NKA酶活性[（31．298±5．779）μmol／（mg·h）]比较，sG组[（14．211±3．885）p．mol／（mg·h）]和TG组[（19．521±1．648）μmol／（mg·h）]明显降低（t=2．54，2．71；P〈0．05）；TG组的NKA酶活性[（19．521±1．648）μmol／（mg·h）]较SG组升高（t=2．51，P〈0．05）。结论特布他林不影响人肺泡上皮细胞存活，并且可以抑制海水浸泡引起的仪-ENaC、NKA—cd含量及NKA活性的下降。