钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功能分析

以钩端螺旋体基因组DNA为模板,通过酶联聚合反应(PCR)得到钩端螺旋体中prmA的同源基因lip-rmA的全基因编码序列,并克隆到原核表达载体pET22b中。通过优化大肠杆菌培养和诱导条件,含目的蛋白的融合蛋白可溶表达量达到40 mg/L,约占菌体总蛋白的40%。经Ni-NTA His Bind亲和柱纯化,得到纯度大于95%的目的蛋白。氨基酸序列同源性分析显示liPrmA与原核生物和真核生物的核糖体蛋白L11甲基化转移酶的功能域一级结构高度一致;活性分析显示,纯化的liPrmA有钩端螺旋体核糖体蛋白L11甲基化转移酶的活性。

用MXAN拟合钩端螺旋体去甲酰化酶XANES谱

钩端螺旋体去甲酰化酶(Leptospira interrogans PDF)是一种重要的含锌金属蛋白酶,对钩端螺旋体这一广泛存在的致病菌的蛋白合成起着关键的催化作用,是一个很好的药物设计靶蛋白．本文测试了LiPDF在pH3．0的溶液状态下的X射线吸收近边结构(XANES：X-Ray Absorption Near-Edge Structure)谱,利用以从头计算(ab．initio)的多重散射(Multiple Scattering)为基础的MXAN方法确定金属蛋白活性中心的精细结构．研究发现结合合适的初始结构模型,可以更好地重现LiPDF蛋白的XANES曲线,从而能够得到更加准确的结构参数．活性中心的精细结构为理解LiPDF的pH依赖的催化活性提供了结构基础．

PRMT5通过抑制NF-κB削弱DR4介导的趋化因子CCL20释放

构建表达DR4的质粒pCMV-DR4-HA(DR4)和表达PRMT5的质粒pCMV-PRMT5-Flag,共转染293T细胞,验证DR4和PRMT5的相互作用.将DR4和蛋白精氨酸N端甲基化转移酶5(protein arginine methyltransferase5,PRMT5)两种质粒分别或者共转染293T细胞,研究PRMT5对DR4引起的炎症因子释放的影响,探讨PRMT5抑制DR4(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor1)引起炎症因子释放的分子机制.分别通过RT-PCR和ELISA方法对炎症因子的表达进行定量检测.通过双荧光报告基因方法检测PRMT5对DR4引起NF-κB活性变化的影响,并且使用WesternBlot方法检测ERK的表达变化.DR4和PRMT5在293T细胞中能相互结合,PRMT5过表达降低了DR4引起的NF-κB活性和ERK的磷酸化,导致CCL20分泌减少.因此,PRMT5在293T细胞中与DR4结合,通过改变NF-κB和ERK激酶活性影响了CCL20的分泌,参与了DR4介导的细胞免疫调节.