猪带绦虫六钩蚴45W基因家族分子克隆

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从激活的猪带绦虫六钩蚴克隆到45W基因家族。通过测序及DNAStar软件分析证实,共得到8个A型转录本、3个与A型转录本相应的B型转录本和4个其它B型转录本,以及1个C型转录本,提示45W相关基因可能更多。在本研究中,发现45W-4B非常保守,有望以此为基础研制出有效的抗猪囊尾蚴病的疫苗。在大肠杆菌中以融合蛋白(GST)的形式对经改造的A型转录本(A3)和B型转录本(B2)进行表达,SDS-PAGE证明,A3呈可溶性表达;B2的表达产物主要形成了包涵体,用强变性剂(6M尿素)处理后再经SDS-PAGE,证明B2也得到了高效表达。Western分析结果表明,二者均与囊虫患者血清不反应或反应很弱;B2能与猪抗六钩蚴血清反应,说明B2可能具有免疫反应性,且其抗原表位可能是线性的。从预测的结果看,猪带绦虫45W蛋白可能是跨膜糖蛋白,跨膜区位于C末端,在它的结构中可能还存在FnⅢ组件。同时,A3和B2蛋白结构中还存在Cn-Em重复单元,以及由16～17个氨基酸构成的α-螺旋的结构单元。在45W蛋白的加工过程中,磷酸化修饰可能是一项重要内容。由此推测,45W蛋白的作用很复杂,可能在调节基因的表达和维持正常的细胞形态等过程中发挥重要的作用。

表达猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原的重组活载体疫苗株的构建

【目的】构建表达猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原的重组鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。【方法】克隆并改造TSOL18基因,构建重组质粒pYA3341-TSOL18,电转入鼠伤寒沙门氏菌终宿主菌株X4550,体外鉴定重组菌X4550(pYA3341-TSOL18)表达蛋白的免疫原性、稳定性、生长曲线、安全性和小鼠免疫试验进行评价。【结果】酶切鉴定和基因序列测定证实重组质粒构建成功;尿素-SDS-PAGE检测有目的蛋白条带,Western Blot证实该抗原具有免疫原性;重组菌株在体外营养选择压力下可稳定地携带重组质粒传代繁殖;蛋白的表达对重组菌株的生长基本没有影响;小鼠实验证实重组菌安全可靠,二免后ELISA检测产生抗体。【结论】成功构建了能稳定表达TSOL18蛋白的可口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(pYA3341-TSOL18)。

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建及免疫原基因的筛选与克隆

研究避开庞大的猪带绦虫基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为策略,利用pSPORT1质粒表达载体首次成功构建了表达文库。经库容量、重组率和代表性测定,库容量达5.0×106,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段10ku基因、18ku基因和45W基因家族的A型、B型、C型转录本,说明文库质量高,代表性强。应用快速筛选质粒表达文库和克隆免疫原基因的技术,成功地筛选和克隆到TsO1基因,其完整阅读框架(ORF)为393bp。将其登录到GenBank(AY327451),经BLAST分析,证实是猪带绦虫六钩蚴发育阶段的1个新免疫原基因。

猪带绦虫六钩蚴45W-4BX的高效表达、纯化及活性分析

截去猪带绦虫六钩蚴45W-4B基因的N端信号肽和C端17个疏水氨基酸序列形成45W-4BX。设计特异性表达引物,PCR扩增目的片段,经BamH和EcoR酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化BL21感受态细胞。用酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆,测序证明阅读框是否正确。用IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳,Western blot分析其活性。包涵体经纯化、透析复性后作为包被抗原检测囊虫猪和囊虫病人血清中的4B抗体。结果表明,截断的4BX(351bp)基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为相对分子质量40000的融合蛋白,并能被囊虫病人血清所识别。ELISA检测表明,囊虫病人血清中含有高滴度的4B抗体,所以45W-4BX的表达产物有可能作为候选抗原用于囊虫病的诊断和免疫预防。

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原的免疫原性

本实验应用体外培养方法制备细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌(ES)抗原,将其与弗氏不完全佐剂乳化后免疫绵羊2次,最后一次免疫后2周每只试验绵羊攻击1000枚虫卵,攻击后7个月剖杀试验羊观察肝肺包囊寄生情况。结果表明六钩蚴ES抗原具有很好的免疫原性,诱导的免疫保护力(减囊率)达96.04％;混合抗原为93.39％,囊液抗原为76.21％,囊壁抗原为30.62％。免疫后试验羊的抗体滴度与免疫保护力之间存在正相关关系。

抗猪带绦虫六钩蚴兔血清的制备及重组质粒pcDNA3.1/TSO45-4B在小鼠骨骼肌的表达

目的:制备抗六钩蚴全虫可溶性抗原的兔血清,观察本室制备的猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TSO45-4B的重组核酸疫苗pcDNA3.1/TSO45-4B经肌肉接种后在宿主体内的表达。方法:用次氯酸钠法孵化六钩蚴,Dot-Blo、tELISA检测兔血清中特异性抗体及滴度;以pcDNA3.1/TSO45-4B进行体内转染,继之免疫组化法观察其在鼠体骨骼肌的表达。结果:抗六钩蚴兔血清多克隆抗体制备成功,抗体效价为1∶20 100;免疫组化染色后在重组质粒注射部位肌肉组织的肌纤维内显示阳性的棕黄色分泌颗粒。结论:重组质粒在小鼠骨骼肌内成功地表达为猪囊尾蚴病多基因DNA疫苗的研制提供了体内表达的依据之一。

猪带绦虫六钩蚴超微结构的观察

目的观察猪带绦虫六钩蚴的超微结构。方法猪带绦虫病患者驱虫,收集成熟虫卵。次氯酸钠法破卵壳后,等渗细胞分离液(Percoll)收集六钩蚴,人工肠液激活。热琼脂离心法制备电镜样品,透射电镜观察。结果猪带绦虫成熟六钩蚴呈卵圆形,(14～17)μm×(10～13)μm,表面有不规则的突起或皱褶。六钩蚴小钩从外至内由颗粒带、纤维层和芯髓组成。成熟六钩蚴具成肌细胞、小钩生发细胞和皮层细胞等几种细胞类型。结论猪带绦虫六钩蚴的超微结构和缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)六钩蚴的超微结构相似,但小钩的结构不同;猪带绦虫六钩蚴有形成上皮的双核细胞。

猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建

目的构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TSO45-4B的真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B。方法全基因合成TSO45-4B的基因序列,并利用PCR扩增该基因序列,将其插入真核表达载体pcDNA3.1,经酶切、测序鉴定。结果经酶切和测序鉴定表明所构建的重组表达质粒中含有TSO45-4B基因。结论成功构建pcDNA3.1/TSO45-4B重组质粒。

猪带绦虫六钩蚴抗原对猪体免疫保护作用的初步研究

本文报告猪带绦虫六钩蚴抗原对猪体的免疫保护作用，结果发现，免疫接种的实验动物没有感染，得到了完全保护，提示六钩蚴抗原对猪体有高度的保护作用；２头未免疫的对照组，１头雌猪感染较重，虫体负荷数为６６８，另１头雄猪没有感染，提示宿主的性别或不同的个体对猪带绦虫的易感性可能有差别。

芬苯达唑对犬钩蚴的杀伤作用观察

目的了解芬苯达唑对犬钩蚴的杀伤作用。方法将染虫犬粪置于固体培养基滤纸上,用竹签轻轻均匀按压,使之与滤纸充分接触,盖上平皿盖,放35℃培养(孵化)箱培养24h后加入药物与犬粪混匀,继续培养,分别与药物作用24、48h后用水洗沉淀法收集虫体,镜下观察钩蚴生长发育情况。实验设不加药对照组。结果培养24h～72h,对照组钩蚴明显长大,虫体自然弯曲、透明、轮廓明显、结构清晰;药物作用24h、48h后虫体僵直、轮廓模糊不清、内部结构消失。结论芬苯达唑对钩蚴有明显杀伤作用,妨碍虫体生长发育。

猪带绦虫六钩蚴表膜结合蛋白45WB_2基因在毕赤酵母中的表达

目的从猪带绦虫六钩蚴总RNA中扩增45WB2基因,并在甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K中获得高效表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从孵化激活的六钩蚴克隆获得459bp的基因,亚克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K中,经测序验证读码框正确后,重组质粒电转化毕赤酵母SMD1168菌株。用PCR方法检测结果表明,目的基因整合进毕赤酵母染色体DNA中。重组菌株用1%甲醇诱导,分别取诱导72和96h的上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)分析。结果重组菌株在毕赤酵母中的表达蛋白分子量为Mr16000,表达产物占上清总蛋白量的32.8%,且能被猪囊尾蚴病患者血清识别。结论基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物有望作为免疫原用于猪囊尾蚴病的免疫预防。

猪带绦虫六钩蚴45W-4B重组蛋白的免疫原性研究

目的观察猪带绦虫六钩蚴45 W-4B抗原对仔猪的免疫保护作用。方法用IPTG诱导表达融合蛋白GST-45W-4B,用GST柱进行纯化,以Montan ide ISA 206为佐剂制成疫苗免疫仔猪。间接ELISA检测仔猪血清抗45W-4B IgG抗体水平,MTT法进行外周血淋巴细胞殖试验。免疫1个月后全部实验组经口攻击感染25000枚/头猪带绦虫虫卵,攻虫3个月后剖检,计算减虫率及保护率。结果免疫组注射疫苗的第2周起,抗体为阳性,45W-4B组持续升高至第8周,淋巴细胞增殖明显高于未免疫感染组。用该抗原制备的疫苗获得了95%的减虫率和33%的保护率。结论该抗原对猪囊尾蚴病具有很好的免疫保护作用。

钩蚴抗原收集和ELISA检测钩蚴抗体的研究

进行钩虫免疫学研究,需收集大量钩蚴制备抗原和建立检测钩蚴抗体的ELISA法。为此,我们于1990年1月对几种常用钩蚴培养方法作了对比,并对ELISA法的敏感性、特异性、稳定性和孵育时间等进行了研究。现将结果综合报告如下。

猪带绦虫六钩蚴的体外培养

采用 12种培养体系培养猪带绦虫六钩蚴 ,结果发现单层细胞且无气相存在的培养体系效果较好 ,促使大部分六钩蚴进入了六钩蚴后期发育 ,且虫体可延长存活至 16d。

猪带绦虫虫卵及六钩蚴膜超微结构的观察

【目的】观察猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构。【方法】猪带绦虫病患者用槟榔、南瓜籽法驱虫,收集成熟虫卵。次氯酸钠法破壳后,等渗percoll溶液收集六钩蚴,人工肠液激活六钩蚴。扫描电镜和透射电镜观察虫卵和六钩蚴。【结果】猪带绦虫成熟虫卵呈卵圆形,直径约为50-58μm,由胚膜、内胞质层、六钩蚴膜和六钩蚴等几部分组成;发育期猪带绦虫六钩蚴的膜结构由外向内分别是外胞膜残留层、外胞质层(包括不规则较致密的外层和均质透明的内层)、胚膜(包括胚层和内胞质层)和六钩蚴膜,而成熟六钩蚴的膜结构仅六钩蚴膜一层,厚度约为49-51nm。【结论】猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构和缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)及肥胖带状绦虫(T.saginata)的超微结构相似,但膜下层的糖原颗粒外周无包膜。

亚洲带绦虫六钩蚴和囊尾蚴的光学显微镜和扫描电镜观察

目的了解亚洲带绦虫六钩蚴和囊尾蚴的形态及其表面超微结构。方法以人工胃液和人工肠液孵化亚洲带绦虫虫卵,密度梯度离心法纯化六钩蚴,于倒置显微镜观察其形态;以及经戊二醛及四氧化锇固定,梯度乙醇脱水,醋酸异戊酯置换,进行临界点干燥,喷碳、喷金,扫描电镜观察其表面超微结构。将六钩蚴经皮下注射感染小鼠,55 d后剖检取囊尾蚴,经胆汁孵化翻出头节,于光学显微镜直接观察或经硼酸卡红染色后镜检。另将囊尾蚴经PBS洗3次,依次经戊二醛固定、四氧化锇固定,梯度乙醇脱水,干燥、喷碳、喷金,扫描电镜观察。结果六钩蚴呈卵形,大小为（10.7~14×14~18.7）μm,表面凹凸不平,形成脊状突起。囊尾蚴呈椭圆形,囊膜表面见疣状突起。头节顶部有吻状顶突,顶突周围及凹陷处均密布大量菜花样突起。吸盘表面不光滑,底部有3~4圈珊蝴样排列的指状突起。颈节表面分布较多大小为（1~3×3~5.5）μm近似球形的颗粒。结论亚洲带绦虫六钩蚴表面凹凸不平,囊尾蚴有明显的吻状顶突,顶突处无小钩,但却分布大量的菜花样突起。

体外人工肠液激活与未激活的猪带绦虫六钩蚴差异蛋白质组学比较

为建立一种用于比较猪带绦虫六钩蚴(Taenia solium)激活前后蛋白差异表达的二维液相色谱方法,本研究对人工肠液激活前后的六钩蚴进行一维色谱聚焦和二维反相色谱分析,以0.3pH为单位在pH7.71～pH5.31的范围内梯度分离出208个激活和197个未激活的六钩蚴蛋白。Mapping tools软件分析结果表明,六钩蚴激活前后的差异蛋白数量为77个,其中激活的六钩蚴差异蛋白44个,未激活的六钩蚴差异蛋白33个。该方法具有分辨率高、重现性好、自动化程度高的特点,为研究六钩蚴与其宿主间的寄生机制提供研究方法。

一氧化氮对猪带绦虫六钩蚴细胞毒作用的研究

目的 研究一氧化氮 (NO)对猪带绦虫六钩蚴杀伤作用。方法 以LPS诱导离体的小鼠腹腔巨噬细胞 ,使其产生NO ;加入猪带绦虫六钩蚴 ,测定 4 8h内六钩蚴的死亡率 ;分别用诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)的抑制剂地塞米松 (Dexam ethasone ,DXS)和左旋硝基精氨酸 (Nω -nitro -L -arginine ,L -NNA)抑制NO产生 ,与未加抑制剂组比较六钩蚴死亡率的变化。结果 LPS可有效诱导巨噬细胞产生NO ,2 0× 10 5巨噬细胞产生的NO浓度为 119 6 4 0 0 +5 115 4 μmol/L ,相应的杀虫率为 79 83%。加入抑制剂DXS和L -NNA后 ,巨噬细胞的NO产量均明显降低 ,其杀虫率也明显降低。结论 活化巨噬细胞产生的NO对猪带绦虫六钩蚴有杀伤作用。

以包涵体形式表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原的复性与纯化

应用比浊法、可溶性蛋白百分比、夹心ＥＬＩＳＡ及变性与非变性ＳＤＳＰＡＧＥ等方法来评价猪带绦虫六钩蚴重组抗原的不同复性条件。透析法复性，透析液为含２ｍｏｌ／Ｌ尿素，１６０μｍｏｌ／ＬＰＥＧ４０００，１．０ｍｍｏｌ／Ｌ０．１ｍｍｏｌ／ＬＧＳＨＧＳＳＧ的ｐＨ９．０的ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液，蛋白浓度为２～５ｍｇ／ｍＬ，以静置缓慢透析为佳，上述条件任意缺一或快速透析，则免疫活性下降，二聚体、多聚体明显增加；稀释法复性，复性液为上述透析液，蛋白浓度０．１ｍｇ／ｍＬ，以分步缓慢稀释为佳。透析法复性与稀释法复性最佳条件的实验结果无显著差别。透析法复性的重组蛋白进行Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ分子筛凝胶层析，出现２个主峰，收集有免疫活性的第１峰进行ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析，用含５０ｇ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ９．０的ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液洗脱，亦出现２个主峰，收集有免疫活性的第１峰。ＳＤＳＰＡＧＥ显示该峰为单一蛋白条带，蛋白纯度大于９０％。夹心ＥＬＩＳＡ检测免疫活性，每１ｍｇ蛋白的效价大于６×１０５。