海蓬子中高亲和钾离子转运体SbHKT1基因的克隆、表达及生物信息学分析

本研究利用RACE技术从真盐生植物海蓬子中获得了高亲和钾离子转运体SbHKT1基因1647bp完整的ORF框。序列分析结果表明,该基因编码548个氨基酸,分子量为62.10kD,理论等电点为9.33;氨基酸序列中第1个～第35个属信号肽序列,第197个～第537个属离子转运体(TrkH)家族特征序列;该基因编码的蛋白具有10个跨膜结构,N端跨膜区及中部膜上呈现明显的疏水性,C端及中部多个跨膜区呈现强疏水性,符合载体类运输蛋白的特点,因此推测SbHKT1蛋白为跨膜运输蛋白。Blast分析显示该蛋白与碱蓬SsHKT1氨基酸同源性高达77%,与冰叶日中花、赤桉和小麦HKT类蛋白的同源性分别为63%、52%和46%。SbHkt1基因表达存在组织特异性:正常生长条件在根、茎中表达较低,在叶片中几乎看不到表达;在高盐低钾的环境下,各组织表达明显升高,高盐低钾胁迫处理8h,其根部表达处于高峰期;经100μmol/L脱落酸处理4h,根部表达达到最高;干旱胁迫(20%PEG6000)处理2h,根部表达量明显上升。由此推断,该基因参与了植物在高盐低钾、渗透、干旱等非生物胁迫下的生理调控。由于目前已克隆的HKT类蛋白基因多来自非盐生植物,对盐生植物内源HKT基因的研究相对较少,因此,海蓬子内源HKT1基因的全长的获得有助于我们进一步研究该基因在高盐钾饥饿环境下运输钾离子,调节植物体内Na+/K+平衡的功能,对于揭示真盐生植物的耐盐机制,将其运用于非盐生植物,培育新的耐盐品种具有一定的意义。

植物质膜钾离子转运体研究进展

近年 ,随着分子生物学技术的不断发展和广泛应用 ,有关植物质膜钾离子转运体的研究取得重要进展。目前已经克隆到多种质膜钾离子转运体基因并对钾离子转运体生化特性以及结构功能进行了广泛研究。研究认为 ,质膜钾离子转运体可分为钾离子载体和钾离子通道。钾离子通道又可分为内向性K+通道α亚基、K+通道β亚基及外向性K+通道等三类。本文对上述质膜钾离子转运体的生化特性以及结构功能研究的进展进行了综述。

钾-氯离子协同转运体2信号通路与神经病理性疼痛的关系

神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)由神经炎症所诱发,主要表现为慢性疼痛和疼痛感觉异常等,常引发焦虑、抑郁和社交障碍,发病率也呈逐年上升态势。神经病理性疼痛发病机制复杂,其中钾-氯离子协同转运体2(K+-Cl-cotransporter 2,KCC2)是调节神经病理性疼痛的重要信号分子,也是神经病理性疼痛的治疗靶点。同时,神经病理性疼痛的干预手段也较局限,而运用电针治疗由选择性坐骨神经分支损伤(Spared nerve injury,SNI)诱导的神经病理性疼痛已得到广泛认可,但其具体作用的分子路径尚不明确。本文对KCC2信号通路与神经病理性疼痛的关系进行综述,为进一步探讨KCC2信号通路是否可能参与电针治疗神经病理性疼痛的过程提供理论依据。

电针对神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏及脊髓背角钾-氯离子协同转运体2表达的影响

目的:观察患侧电针和健侧电针足三里穴、阳陵泉穴对神经病理性疼痛大鼠行为学表现以及脊髓背角钾-氯离子协同转运体2(KCC2)表达的影响,探讨患侧选穴和健侧选穴两种针刺方案的镇痛效应,以及KCC2在电针镇痛效应中的作用。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为4组:假模组、模型组、患侧电针组、健侧电针组,每组10只。建立大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型,治疗组于术后1周开始电针治疗,每天1次,连续7天。各组于术前(0天)及术后3、5、7、10、12、14天分别测量大鼠患侧足机械足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)。术后14天处死大鼠,取脊髓组织行HE染色观察组织病理学改变,并采用免疫组化方法检测脊髓背角KCC2蛋白的表达。结果:与术前比较,CCI各组大鼠痛阈明显降低,出现痛觉过敏(P<0.001),电针治疗后大鼠MWT和TWL均有不同程度的持续升高,且患侧与健侧电针相比无明显差异。HE染色结果提示,患侧电针组与健侧电针组脊髓背角组织及神经元病变程度较模型组减轻。术后14天患侧与健侧电针组较模型组脊髓背角患侧KCC2表达显著增加(P<0.05),并且患侧电针组与健侧电针组无明显差异。结论:患侧电针和健侧电针能产生类似的镇痛效果,均可减轻外周神经损伤后引起的痛觉过敏。患侧电针与健侧电针治疗均可抑制KCC2蛋白的表达下调,电针的镇痛作用可能是通过增加脊髓背角中KCC2的表达实现的。

高盐饮食对更年期焦虑小鼠海马钾离子-氯离子共转运体2、钠-钾-氯离子失转运体1表达的影响

目的研究高盐饮食对更年期焦虑症小鼠钾离子-氯离子共转运体2(KCC2)、钠-钾-氯离子共转运体1(NKCC1)表达的影响。方法将大鼠随机分为空白组、模型组、4%高盐饮食组、8%高盐饮食组。其中4%高盐饮食组、8%高盐饮食组经高盐饮食干预1个月后,HE染色观察脑部结构,免疫组织化学观察KCC2、NKCC1表达情况。结果高盐饮食使更年期焦虑小鼠海马区锥体细胞排列紊乱,神经元数目明显减少,细胞轮廓模糊,出现大量的空泡现象,细胞形态不规则,细胞间隙明显增大;模型组KCC2表达的阳性细胞明显减少,高盐饮食组阳性细胞极少;模型组NKCC1表达阳性细胞明显增多,高盐饮食组阳性细胞增多更明显。结论高盐饮食加重更年期焦虑症的发生可能与KCC2及NKCC1之间的动态平衡被打破有关。

成年大鼠小脑Purkinje神经元不表达神经元特异性的钾离子氯离子共转运体2

目的:观察神经元特异性标记物钾离子氯离子共转运体2(KCC2)在成年大鼠小脑皮质的表达。方法:成年SD大鼠,4%多聚甲醛灌注固定,取脑,冷冻切片,KCC2和小脑Purkinje神经元标记物Calbindin-D28K在小脑的免疫荧光双标,激光共聚焦显微镜观察。结果:KCC2在颗粒细胞层神经元有丰富的表达,但在Purkinje神经元表达很弱。结论:神经特异性的KCC2可能不是成年大鼠的Purkinje神经元的离子型γ-氨基丁酸受体发挥抑制性作用的主要因素。

运动训练对脊髓损伤后痉挛大鼠脊髓内钾-氯离子协同转运体2表达的影响

目的:研究运动训练对脊髓损伤(SCI)后痉挛大鼠行为学表现及脊髓内钾-氯离子协同转运体2(KCC2)表达的影响,探讨KCC2在运动训练的解痉效应中的作用。方法:将30只雌性SD大鼠随机分为假手术组、对照组、实验组。采用改良Allen撞击法建立脊髓损伤后痉挛模型,使用BBB评分、Ashworth评分来评估三组大鼠术后行为学变化,并于术后5周用免疫组化技术检测各组大鼠损伤远段脊髓KCC2表达。结果:假手术组术后行为学评分一直保持正常。术后1d—5周,对照组和实验组的BBB评分均持续升高,且2组组内不同时间点的BBB评分差异均有显著性意义(P<0.05)。术后2—5周,实验组评分均高于对照组,且差异均有显著性意义(P<0.05)。对照组和实验组在术后1周左右出现痉挛,后痉挛程度逐渐加重,至术后5周左右降低,2组组内不同时间点的Ashworth评定结果差异均有显著性意义(P<0.05)。术后3—5周,对照组评定等级均高于实验组,差异有显著性意义(P<0.05)。三组大鼠脊髓运动神经元胞膜上KCC2表达水平比较,组间差异有显著性意义(P<0.05)。与假手术组相比,其余两组大鼠KCC2蛋白表达下调(P<0.05);与对照组相比,实验组能够明显上调KCC2蛋白的表达(P<0.05),但仍低于假手术组(P<0.05)。结论:运动训练可以促进脊髓损伤后运动功能恢复,有效缓解痉挛,并可抑制KCC2表达的下调,运动训练的解痉效应可能是通过增加KCC2表达实现的。

大鼠视上核和室旁核神经元钾离子氯离子共转运体2表达探讨

目的观察神经元特异性标记物钾离子氯离子共转运体2在成年大鼠下丘脑视上核和室旁核的表达。方法成年SD大鼠,4%多聚甲醛灌注固定,取脑,冰冻切片,下丘脑部进行钾离子氯离子共转运体2和神经细胞核抗原免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。结果钾离子氯离子共转运体2在视上核和室旁核神经元中表达很弱。结论下丘脑视上核和室旁核部分神经元缺少神经特异性的钾离子氯离子共转运体2表达。

钾-氯离子协同转运体2与癫痫

钾-氯离子转运体2仅在中枢神经系统表达,具有神经元特异性。KCC2在维持神经元内氯离子的浓度发挥重要的作用,它主要调节细胞内Cl-的外向流量,使神经元内氯离子浓度低于它的电化学平衡单位,使γ-氨基丁酸能神经元发生超级化的突触后抑制性反应。KCC2在癫痫发病过程中具有重要的作用,在神经元内KCC2的表达减少,使细胞内Cl-增加,改变了神经元内Cl-的稳态,改变γ-氨基丁酸的突触后抑制性电位,GABA能反应向去极化方向转换,促进癫痫发生与发展。

盐角草高亲和钾离子转运蛋白SeHKT1基因的克隆及表达分析

利用RACR技术从盐生植物盐角草中克隆Se HKT1基因,Gen Bank登录号为KP739261,用生物信息学方法对获得的基因序列进行分析,利用q RT-PCR方法研究Se HKT1基因在不同组织和不同盐胁迫下的表达特性。结果表明,该基因c DNA序列含有1个1 761 bp的完整ORF,编码550个氨基酸,Blast分析表明该蛋白与毕氏海篷子Sb HKT1蛋白亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明Se HKT1基因在Na Cl处理下地上部和地下部均诱导上调表达,主要在盐角草根部表达,在地上部表达相对较低,200mmol/L Na Cl处理6 h后在根部表达量达到最高,随后逐渐降低;在钾饥饿条件下,该基因在根部和地上部的相对表达量均高于对照。说明Se HKT1不仅能响应N a Cl胁迫,还能在缺钾条件下提高表达,发挥高亲和钾离子载体功能。

APP/PS1小鼠嗅球神经元的早期树突分支和长度及钾-氯离子共运转体2蛋白表达异常

目的探讨嗅球(OB)神经元的形态和相关蛋白的变化,探讨导致阿尔茨海默病(AD)嗅觉功能障碍的原因。方法采用高尔基-考克斯(Golgi-Cox)染色技术评估AD模型小鼠(APP/PS1小鼠)的OB和前梨状皮质(aPC)的神经元形态变化;使用Sholl分析对神经元的形态学进行测量;采用Western blotting检测蛋白质表达水平。结果高尔基-考克斯染色结果显示,在3~5月龄,该模型鼠尚未表现出AD的病理特征及认知障碍时,OB已经发生神经元树突长度和分支数量的显著减少。Western blotting检测发现,对神经元形态和突触功能至关重要的钾-氯离子共转运体2(KCC2)蛋白表达在3~5月龄APP/PS1小鼠的OB中显著降低。结论异常的神经元形态和KCC2信号途径改变可能是AD早期嗅觉功能障碍的基础;维持KCC2信号正常有望成为干预AD早期嗅觉异常的有效途径之一。

氯离子转运蛋白NKCC1在老年小鼠术后认知功能障碍中的作用

目的探讨氯离子转运蛋白钠离子钾离子氯共转运体1(NKCCl)在老年小鼠术后认知功能障碍(POCD)中的作用。方法选择老年雄性C57BL/6小鼠40只,18~20月龄,体重28~32 g。将小鼠随机分为四组:对照+生理盐水组(N组),对照+布美他尼(NKCC1抑制剂)组(B组),POCD模型+生理盐水组(M组)和POCD模型+布美他尼组(MB组),每组10只。采用异氟醚麻醉和剖腹探查术建立POCD动物模型,于术后3~7 d行旷场与条件恐惧实验评估认知功能;行为学结束后采用Western blot法检测海马组织NKCC1、钾离子氯离子共转运体2(KCC2)、脑源性神经营养因子(BDNF)及突触后密度蛋白95(PSD95)的蛋白含量,免疫组织荧光检测海马组织CA1、CA3、DG区NKCC1免疫荧光强度。结果与N组比较,M组场景僵直时间明显缩短(P<0.05),海马NKCC1蛋白含量明显升高(P<0.05),BDNF、PSD95蛋白含量明显降低(P<0.05),海马组织CA1、CA3、DG区NKCC1免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。N组和B组各指标差异均无统计学意义。与M组比较,MB组场景僵直时间明显延长(P<0.05),海马NKCC1蛋白含量明显降低(P<0.05),BDNF、PSD95蛋白含量明显升高(P<0.05),海马组织CA1、CA3、DG区NKCC1免疫荧光强度明显减弱(P<0.05)。结论NKCC1可能在老年小鼠POCD中发挥关键作用,其机制可能与突触相关蛋白BDNF与PSD95表达水平下调有关。

嗜盐耐盐微生物抗盐胁迫相关离子转运蛋白研究进展

离子转运蛋白在维持细胞内pH稳态、离子动态平衡等方面发挥着重要作用。钠离子转运体和钾离子转运体在嗜盐耐盐微生物中广泛存在,其“保钾排钠”机制是微生物抗盐胁迫的两大策略之一。近年来,嗜盐耐盐微生物中许多新型钠、钾离子转运体被陆续发现,如RDD蛋白、UPF0118蛋白、DUF蛋白和KimA蛋白等;Fe^(3+)、Mg^(2+)等其他金属离子的转运蛋白也被证实可通过影响微生物胞内相容性溶质的合成起到渗透调节的作用。本文综述了嗜盐耐盐微生物中抗盐胁迫相关的各类离子转运蛋白,分析其分子结构和工作机理,并对这些蛋白在农业方面的应用进行了展望。继续发现新的离子转运蛋白,探究抗盐胁迫相关离子转运蛋白的结构和机理,解析各转运系统的协同作用及分子调控机制,将进一步加深对嗜盐耐盐微生物抗盐胁迫调控的认识,并为盐碱地农作物的改良等提供新的思路。

钾-氯离子协同转运体2参与痛觉敏化形成的研究进展

背景痛觉敏化的机制尚未清楚，以往研究集中在神经系统兴奋性增强，近年来抑制性功能下调在痛觉敏化中的作用引起关注。中枢神经系统抑制性受体^y氧基丁酸A（γ-aminobutyricacidA，GABA。）受体的标志性蛋白之一钾-氯离子协同转运体2（K＋-Cl-cotransporter2，KCC2）在神经元从抑制到兴奋的转变中起了重要作用。KCC2通过影响Cl-的浓度来影响吖一氨基丁酸／甘氨酸所介导的抑制作用，进而影响神经系统兴奋性。目的就KCC2在痛觉敏化发生过程中的作用及相关通路进行综述。内容多种细胞外信号可以激活小胶质细胞并且引起P2X4Rs的上调；P2X4Rs的激活触发脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）从小胶质细胞的释放；BDNF到神经元的酪氨酸蛋白激酶B受体（tyrosine kinase Breceptor，TrkB）信号通路改变KCC2的功能，导致神经元Cl-外排能力的降低，从而抑制1弓瓦基丁酸／甘氨酸所介导的抑制作用。趋向研究KCC2参与痛觉敏化形成的机制，为痛觉过敏化的治疗提供新的靶点。

脊髓水平钾氯离子协同转运体2在尼古丁戒断大鼠痛觉过敏中的表达

目的观察尼古丁戒断后大鼠痛觉过敏中脊髓水平钾氯离子协同转运体2（K＋-Cl-cotransporter2，KCC2）的表达。方法健康雄性sD大鼠60只，体重180g～250g，采用随机数字表法分为3组：正常对照组（C组，12只）、生理盐水组（NS组，12只）、尼古丁戒断组（NT组，36只）。C组不注射，Ns组和NT组分别皮下注射生理盐水、尼古丁3mg／kg，3次，d，连续7d，末次注射后60min皮下注射美加明1mg／kg。观察大鼠尼古丁戒断后热缩足反射阈值（thermalwithdrawallatency，TWL）的变化及脊髓KCC2表达水平。采用免疫荧光法检测大鼠脊髓KCC2的分布，Westernblot法检测KCC2蛋白的表达变化。结果NS组TwL与C组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；与c组比较，NT组TwL在尼古丁戒断后1d-7d显著缩短（P〈0．01），且在尼古丁戒断后第4天降为最低[（16．2±0．6）s比（8．4±0．3）s]（P〈0．01）。C组和Ns组脊髓水平KCC2表达相对值比较差异无统计学意义（P〉0．05）；NT组脊髓背角浅层的KCC2表达相对值较C组显著减少[（1．042±0．022）比（0．231±0．013）]（P〈0．01）。结论尼古丁戒断后大鼠痛觉过敏形成中脊髓背角浅层的KCC2表达降低。

商陆PaHAK1与拟南芥HAK/KUP/KT家族基因的比较分析

为探明商陆高亲和性K+转运体基因(Pa HAK1)的结构、功能及商陆耐低钾的原因,分析比较了商陆Pa HAK1和拟南芥HAK/KUP/KT家族基因中15个基因编码的高亲和性钾离子转运体氨基酸序列、蛋白质结构及其理化性质。结果表明:HAK基因家族编码蛋白均定位于细胞膜上,含有多个跨膜结构且跨膜结构域是蛋白质的保守结构域;Pa HAK1与At KUP3的跨膜结构十分相似,低钾胁迫下Pa HAK1和At KUP3的高表达与其高亲和钾转运吸收功能密切相关。系统进化树分析结果表明,Pa HAK1与拟南芥HAK基因家族中At KUP8亲缘关系最近,其氨基酸序列相似度为76.98%,推测Pa HAK1还可能通过维持细胞内高水平钾量在水分胁迫下发挥重要的调节作用。

筇竹CtHAK1基因的克隆及表达分析

为了研究钾转运载体HAK家族基因在竹笋以及竹子运输钾的特征,以筇竹实生苗(2 a)为研究材料,克隆出钾转运载体基因,命名为CtHAK1(基因登录号为:MT078978),并分析其表达特征。结果表明,CtHAK1基因全长为2633 bp,开放阅读框为2361 bp,编码786个氨基酸,相对分子量为87.91 kD,理论等电点(PI)为8.82。聚类分析显示CtHAK1与芦苇同源性最高,达到93.88%,亚细胞定位预测主要存在于细胞质膜上(60%)。RT-PCR结果显示,CtHAK1基因在不同组织(笋、根、茎、叶)中均有表达为非诱导表达,表达量由大到小为茎、根、叶、笋。KCl处理下筇竹根、茎部基因表达呈下调趋势,而叶呈上调表达,并且处理过程叶部的表达量始终高于根部和茎部的表达量。

大鼠缰内侧核神经元缺少MAP2和KCC2的表达

为了观察神经元结构蛋白微管相关蛋白2(MAP2)和钾离子-氯离子共转运体2(KCC2)在缰内侧核神经元内的表达,本实验采用2组成年SD大鼠,一组作常规灌注固定,冰冻切片,KCC2和MAP2的免疫荧光组织化学染色;另一组断头取脑,分别取缰内侧核和缰外侧核,用Western blotting法检测KCC2和MAP2的表达。结果显示:KCC2和MAP2在缰内侧核内的表达非常弱,但在缰外侧核有丰富表达。以上结果表明,缰内侧核神经元缺少神经元结构蛋白MAP2和KCC2的表达。

NKCC1和KCC2在致痫性局灶性脑皮质发育不良中表达差异性研究

目的探讨钠-钾-氯离子共同转运体1(bumetanide-sensitive sodium-potassium-1-chloride transporter,NKCC1)和钾-氯离子共同转运体2(K+-C1-cotransporter 2,KCC2)在致痫性局灶性脑皮质发育不良中表达差异性情况及其意义。方法依据新疆喀什地区第一人民医院及南方医科大学南方医院病理科的术后病理诊断,参考局灶性脑皮质发育不良(focal cortical dysplasia,FCD)Palmini分型标准,将采集实验标本分为FCDⅠa、Ⅰb、Ⅱa和Ⅱb 4组。实验设置实验组和自身对照组,实验组标本取材于手术中皮层脑电监测提示的癫痫责任灶皮质,自身对照组标本取材于皮层脑电监测提示的非癫痫责任病灶皮质,用实时荧光定量核酸扩增(RT-QPCR)和蛋白质印迹(WB)分别在mRNA水平和蛋白水平分析NKCC1和KCC2在FCD不同亚型间的表达及其差异性。结果 49例病例共分为4组,包括FCDⅠa(10例),FCDⅠb(20例),FCDⅡa(9例),FCDⅡb(10例)4组。WB研究中共纳入47例,RT-QPCR研究中49例病例全部纳入。FCDⅠa亚型中NKCC1和NKCC1mRNA表达与自身对照组比较均未见明显变化,而KCC2表达下调,KCC2mRNA表达上调;FCDⅠb亚型中NKCC1和NKCC1mRNA表达与自身对照组比较均未见明显变化,而KCC2和KCC2mRNA表达均下调;FCDⅡa亚型中NKCC1和NKCC1mRNA表达均上调,而KCC2和KCC2mRNA表达均未见明显变化;FCDⅡb亚型中NKCC1和NKCC1mRNA表达均上调,而KCC2表达下调,KCC2mRNA表达上调。结论只有FCDⅡb亚型同时涉及了NKCC1和KCC2 2种蛋白的表达异常,而其他3种亚型中仅单一涉及NKCC1或KCC2的表达异常;在蛋白表达调节层面,转录层面的调节在NKCC1的表达异常中较为重要,而转录层面和转录后层面的调控在KCC2的表达异常中同时发挥了重要作用。

腺相关病毒介导的脑源性神经营养素对脊神经结扎大鼠的镇痛机制

目的探讨脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)大鼠鞘内注射腺相关病毒(adeno⁃associated virus,AAV)介导的脑源性神经营养素(BDNF)对神经病理痛的影响及可能的机制。方法将SD大鼠随机分为:正常组、SNL组、生理盐水(NS)组、空载(AAV0)组、BDNF组、BDNF+KCC2拮抗剂(Furos)组、BDNF+NS组。于造模前、注射后0、3、7、14、21 d分别测量大鼠患侧痛阈值。结束后WB检测脊髓背角BDNF、KCC2蛋白表达。结果造模后,各组与正常组比较痛阈值明显下降(P<0.001);注射后14、21 d,BDNF组与SNL、NS、AAV0组比较痛阈值升高(P<0.001)。BDNF+Furos组注射后痛阈值明显低于BDNF、BDNF+NS组(P<0.001)。注射后21 d,BDNF组与SNL、NS、AAV0组比较BDNF、KCC2表达上调(P<0.001);BDNF+Furos组与BDNF、BDNF+NS组比较,KCC2表达下降(P<0.001)。结论AAV介导的BDNF在鞘内表达对SNL大鼠可起到镇痛作用,此作用与KCC2的上调有关。