12种真菌钾离子通道蛋白生物信息学分析

利用生物信息学对真菌钾离子通道蛋白进行序列分析,推断并预测其结构和功能。本文筛选了酿酒酵母、黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、玉米黑粉菌、布拉克须霉等12种真菌的钾离子通道蛋白,综合采用Blast、Prot Param、Signal P和Swiss-Model等生物信息学网站和软件对这些蛋白的理化性质、系统进化、蛋白结构和功能域等进行了分析。结果表明:所选择的钾离子通道蛋白氨基酸序列长度在659~928 aa之间,理论等电点在5.45~9.54之间,主要定位在质膜、液泡上。二级结构分析表明,真菌钾离子通道蛋白均由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成,其空间结构高度相似,且12种钾离子通道蛋白都拥有保守的Tx GYGD钾离子选择器特征片段。

检测心肌细胞钾离子通道蛋白活化水平方法的优化

介绍了一种如何合理的利用蛋白质免疫沉淀和蛋白质免疫印迹相结合的方法检测大鼠心肌细胞钾离子通道蛋白Kv1.2和Kv1.5的表达与活化水平。实验结果表明,与单独利用免疫印迹的方法相比较,本实验是对钾离子通道蛋白及其它亚家族的钾通道蛋白磷酸化表达水平检测方法的一种优化,从而获得一套可行、简单、合理的实验方案,同时也提高了检测的准确性,敏感性及特异性。

血管紧张素(1-7)通过抑制中电导钙激活钾离子通道蛋白表达参与肾脏纤维化

目的探讨血管紧张素(Ang)(1-7)在肾纤维化过程中的保护作用与中电导钙激活钾离子通道(KCa3. 1)的关系。方法 60只雄性小鼠随机分为5组:对照组(WT);血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)组:皮下注射AngⅡ[1. 4 mg/(kg.d)];注射AngⅡ的同时给予以下药物干预:AngⅡ阻断剂洛沙坦(Losartan)组:皮下注射Losartan[40 mg/(kg.d)];Ang (1-7)组:皮下注射Ang(1-7)[0. 14 mg/(kg.d)];血管紧张素转化酶2(ACE2)激动剂重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐(DIZE)组:皮下注射DIZE[10 mg/(kg.d)]。连续给药4周后对相关指标进行检测。Masson染色法检测肾组织胶原沉积变化;Western blotting法检测肾组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和KCa3. 1通道蛋白表达的变化。结果与对照组相比,AngⅡ组小鼠肾组织内胶原沉积量明显增加(n=12,P<0. 01),表明肾纤维化模型复制成功。AngⅡ使肾组织Ⅰ、Ⅲ型胶原合成显著增多(n=6,P<0. 01),同时促进了肾组织KCa3. 1通道蛋白的表达(P<0. 01),而Ang (1-7)及ACE2激活剂DIZE的应用抑制了肾组织内胶原沉积量、Ⅰ/Ⅲ型胶原合成及KCa3. 1通道蛋白的表达(n=12或6,P<0. 01)。结论 Ang (1-7)在肾纤维化过程中发挥保护作用,这一作用可能与其下调肾组织中KCa3. 1通道蛋白表达有关。

依赖电压的钾离子通道蛋白结构解析

据英国 Nature,2003,423:33报道,美国洛克菲勒大学的麦克金农(R.MacKinnon)等测定了一种依赖电压的钾离子通道蛋白的高分辨 X 射线衍射结构图。其电压传感结构域的分辨率达到0.19纳米。

马铃薯钾离子通道蛋白SKT1的原核表达与纯化

克隆马铃薯(Solanum tuberosum L.)钾离子通道蛋白SKT1基因片段后原核表达并纯化SKT1蛋白,为进一步研究SKT1的晶体结构与功能,以及与其它钾离子通道蛋白的相互作用奠定基础.以马铃薯试管苗总RNA反转录出的cDNA为模板,PCR扩增SKT1蛋白的胞内区,基因片段为1758bp,构建原核表达载体pET30-SKT1,转化大肠杆菌BL21表达株菌,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE检测发现SKT1蛋白主要是以包涵体的形式存在.利用6M盐酸胍对SKT1包涵体进行溶解,利用Ni柱亲和纯化,最后在复性缓冲液中复性.获得了SKT1蛋白,复性得率大于40%,纯度达到95%以上,Western Blotting鉴定正确.

钾离子通道相互作用蛋白1与γ-氨基丁酸能神经元在戊四唑致癫痫大鼠海马部位的改变

目的研究钾离子通道相互作用蛋白1(KChIP1)在癫痫发生过程中的变化及其与γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的关系。方法成年大鼠制作急性戊四唑癫痫模型,免疫组织化学法结合激光扫描共聚焦显微镜技术观察大鼠脑中KChIP1免疫阳性神经元与GABA能阳性神经元在海马部位的表达及改变。结果急性戊四唑癫痫大鼠海马部KChIP1阳性神经元数较对照组明显增加(P<0.05),GABA能阳性神经元、KChIP1/GABA双标阳性神经元数与对照组无显著性差异(P>0.05);KChIP1和GABA能阳性神经元在海马部位的共存率约为63.9%。结论KChIP1在癫痫发生中可能起重要作用;KChIP1与GABA能神经元虽有密切的共存关系,但在功能上并不完全一致。

麂亚科动物钾离子通道基因片段及其内含子序列的克隆与进化分析

运用PCR扩增、T A克隆、测序等技术,获得黑麂,小麂,赤麂和毛冠鹿4种麂亚科动物基因组DNA的钾离子通道部分序列。序列分析表明:麂属动物之间的外显子区域序列差异为0.90%～1.44%,毛冠鹿与麂属动物之间的差异为0.90%～1.26%,可见这一段序列的同源性较高。而内含子部分序列差异在麂属动物之间的差异为0～1.22%,毛冠鹿与麂属动物的差异为1.83%左右。由NJ法和最大简约法(Mp法)构建的进化树表明黑麂与赤麂亲缘关系较近,小麂与他们同为一属但关系较远,而毛冠鹿与它们之间的分化程度已达到属间水平。研究表明基因组的内含子序列能够较真实反映近缘动物之间的关系,是进行分子进化比较分析的较理想标记。

钾离子通道相互作用蛋白1在大鼠脑中的分布及其与GABA能神经元的关系

目的与方法用免疫组织化学法结合激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察钾离子通道相互作用蛋白1(KChIP1)免疫阳性神经元在大鼠脑中的分布及其与GABA能阳性神经元的定位关系,研究钾离子通道相互作用蛋白1(KChIP1)的功能。结果KChIP1免疫阳性神经元在大鼠皮层、海马均可见,海马部位KChIP1阳性神经元主要分布于锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层;KChIP1阳性和GABA能阳性神经元在正常大鼠大脑顶叶皮层和海马部位的共存比例分别为63.94%、63.11%。结论在大鼠脑内,KChIP1主要与抑制性GABA能神经元共存发挥其调节神经元兴奋性的功能。

钾离子通道相互作用蛋白与Kv4

钾离子通道为心肌复极的主要离子通道,其中构成Ito的Kv4主要存在于左心室外膜下心肌。但体外表达研究表明,Kv4通道电流与体内存在的Ito性质并不一致,这表明还存在其他一些辅助亚单位与Kv4共同构成Ito,其中一类最重要的β亚单位为钾离子相互作用蛋白(KChIPs)。KChIPs为一类钙离子结合蛋白,现已发现4种KChIPs基因。KChIPs与Kv4在体外共同表达时,KChIPs可增加Kv4在细胞膜上的表达,减慢失活以及加速复活,这样使产生的电流接近于体内存在的心室Ito。

人钾离子通道调节蛋白的原核表达及纯化

目的:探讨人钾离子通道调节蛋白(KCNRG)的原核表达体系和纯化条件,为该蛋白的功能机制研究提供工具。方法:以pcDNA3.1-KCNRG-2ex重组质粒为模板,采用特异引物扩增KCNRG基因编码区。PCR 产物双酶切后克隆入pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1 载体中。重组的pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG质粒转化Top10感受态细胞。鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化Rosetta(DE3)蛋白表达菌株,IPTG 诱导表达,用SDS-PAGE 及Western blot检测重组融合蛋白的表达。结果: PCR扩增产物长度为819 bp。经双酶切和测序,鉴定重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG构建成功。SDS-PAGE检测,KCNRG-MBP融合蛋白在菌液的上清中表达,KCNRG-GST融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot 检测,重组KCNRG-MBP蛋白和重组KCNRG-GST蛋白分别能被抗6×His 抗体和抗GST抗体识别。经镍柱亲和层析纯化,获得纯化的KCNRG-MBP融合蛋白(凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度>90%)。结论:成功构建重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His,并实现KCNRG-MBP融合蛋白的可溶性原核表达。

间斑寇蛛毒致痛大鼠脊髓神经元细胞中钙离子激活的内向整流钾通道蛋白表达

目的分析不同浓度间斑寇蛛毒致痛大鼠脊髓灰质神经元细胞中钙离子激活的内向整流钾通道（IK1）的蛋白表达变化。方法选取36只雄性sD大鼠，采用分层随机抽样法分为对照组（4只）和毒素组（32只），毒素组分别于右后足趾部皮下注射10、40、100、300μl／kg间斑寇蛛粗毒液，每种浓度各8只。观察毒素组大鼠注射毒液后的缩足反应。对照组不做处理。24h后将所有大鼠断颈处死，取样第4—5腰椎脊髓样本，采用苏木精一伊红（HE）染色法观察脊髓神经元细胞结构，采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连结（SP）法观察神经元细胞中IKl蛋白的表达情况，采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测IK1 mRNA的表达水平。分析不同浓度下IK1 mRNA及蛋白表达的变化。采用Pearson相关性检验分析大鼠缩足次数与毒液浓度的相关性。结果注射间斑寇蛛毒15min后毒素组大鼠1h内的缩足次数分别为（44±16）、（64±9）、（69±19）、（91±35）次，Pearson相关性分析显示不同浓度下的1h缩足次数与毒液浓度呈正相关（F2=0．548，P〈0．05）。对照组及10、40、100、300μl／kg毒素组大鼠脊髓神经元细胞中平均IK1蛋白阳性细胞数分别为（2．0±1．0）、（5．0±2．0）、（6．0±1．0）、（6．0±2．0）、（7．0±1．0）个；各毒素组平均阳性细胞数均明显高于对照组，40、100、300μl／kg毒素组明显高于10μl／kg毒素组（均P〈0．05），40、100、300μl／kg毒素组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。对照组及10、40、100、300bd／kg毒素组大鼠脊髓中IK1 mRNA的相对表达量分别为（0．56±0．16）、（0．62±0．27）、（1．27±0．10）、（1．53±0．29）、（1．61±0．86）；各毒素组IK1 mRNA表达水平均明显高于对照组，40、100、300bd／kg毒素组明显高于10μl／kg毒素组（均P〈0．05），40、100、300μl／kg毒素组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论问斑寇蛛毒具有急性致痛作用，与毒素呈浓度依赖性；其疼痛传递机制依赖于钙离子激活的IK1 mRNA及蛋白在脊髓神经元细胞中的表达。

钾离子通道在黄曲霉菌孢子萌发中的作用

黄曲霉毒素严重污染农产品,威胁人畜生命健康,而孢子萌发是黄曲霉菌生存及侵染过程中的决定性事件,从最上游阻断孢子萌发可能是有效控制黄曲霉污染、开发新型抗菌药物的突破口之一。研究发现一定浓度的胞外KCl能够影响黄曲霉孢子的萌发。通过使用K+特异性荧光探针PBFI-AM,发现适合孢子萌发的特定浓度K+能够激发黄曲霉孢子瞬间产生较高的钾离子流,说明K+响应可能是黄曲霉孢子萌发的早期信号。4-AP作为特异性电压门控钾离子通道阻滞剂,能够明显抑制并延迟孢子的萌发。通过生物信息学预测,发现黄曲霉菌KCNA具有钾离子通道选择器序列,具备电压门控钾离子通道的α亚基属性。进一步构建KCNA非洲爪蟾卵母细胞表达体系,用双电极电压钳系统测得KCNA外向型电流,一定程度上证明了KCNA电压门控钾离子通道蛋白质属性,也说明电压门控钾离子通道参与了黄曲霉孢子萌发。

内向整流钾离子通道与视网膜疾病的关系

内向整流钾离子通道(inwardly rectifying K+channel,Kir通道)是钾离子通道家族中的一个亚类,在各种组织细胞中广泛分布,在维持机体环境稳态中具有重要作用.近期研究显示,其亦存在于视网膜色素上皮、视网膜神经元、胶质细胞及血管细胞中,具有维持视网膜渗透压稳态,抵抗神经毒性及氧化应激,参与视觉形成等重要作用.Kir通道参与了糖尿病性视网膜病变、遗传性KCNJ13视网膜病变、青光眼等多种视网膜疾病的发生发展.

美托洛尔对大鼠心肌梗死后Th1平衡以及钾通道Kv2.1和KIR2.1表达的调控

目的:探究美托洛尔对心肌梗死(MI)大鼠的保护作用,并初步探究其可能的作用机制。方法:将大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(MI)、美托洛尔低、中、高剂量组(L-metoprolol、M-metoprolol、H-metoprolol)。血液动力学检测大鼠心室功能;TTC染色法检测心肌梗死面积;酶联免疫法检测血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平,流式细胞术Th1/Th2细胞比率;蛋白免疫印迹法检测T-bet、GATA-3、Kv2.1、KIR2.1蛋白表达。结果:与Sham组相比,MI组大鼠LVEDD、LVESD显著升高,LVEF、SV、FS显著降低,MAP、LVSP、+dp/dtmax降低,LVEDP、-dp/dtmax显著升高,心肌梗死面积比例升高,血清IFN-γ、IL-2水平升高,IL-4、IL-10水平降低,Th1细胞比率升高,Th2细胞比率降低,Th1/Th2比值升高,T-bet蛋白表达升高,GATA-3蛋白表达降低,Kv2.1、KIR2.1蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与MI组相比,美托洛尔低、中、高剂量组LVEDD、LVESD显著降低,LVEF、SV、FS显著升高,MAP、LVSP、+dp/dtmax升高,LVEDP、-dp/dtmax降低,心肌梗死面积比例降低,血清IFN-γ、IL-2水平降低,IL-4、IL-10水平升高,Th1细胞比率降低,Th2细胞比率升高,Th1/Th2比值降低,脾脏、心肌组织T-bet蛋白表达降低,GATA-3蛋白表达升高,Kv2.1、KIR2.1蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:美托洛尔可降低MI大鼠梗死情况,保护大鼠心功能,这可能是通过恢复Th1/Th2平衡,延迟整流钾电流,上调钾通道Kv2.1和KIR2.1蛋白表达实现的。

探究GIRK蛋白与小鼠三叉神经痛中疼痛行为的相关性

目的 三叉神经痛是最常见的颌面疼痛综合征,其病因尚未完全明确。本文主要研究G蛋白门控内向整流钾离子通道(G Protein-gated Inwardly Rectifying Potassium Channel,GIRK)蛋白在三叉神经痛中的作用及表达情况,为三叉神经痛的治疗提供新方向。方法 通过眶下神经横断手术建立小鼠的三叉神经痛动物模型,利用Von Frey测量其机械性异常性疼痛;记录其面部抓挠次数来测量其自发痛;使用Western Blot检测三叉神经节中GIRK蛋白的表达情况。结果 研究发现,小鼠三叉神经损伤后,与对照组相比,其机械性异常性疼痛和自发痛在术后3-21天均有显著性增强,而三叉神经节中GIRK1-3蛋白水平均下调。结论 本研究成功建立了小鼠的三叉神经痛模型,表明GIRK可能在神经损伤后的三叉神经痛中发挥重要作用。

发菜盐胁迫响应蛋白TrkA-N的克隆及在大肠杆菌中表达

前期通过高通量转录组测序对不同浓度盐胁迫下发菜的差异表达基因进行了分析,结果发现钾离子通道蛋白Trk A-N在0. 3 mol/L盐浓度下转录水平比无盐时明显下调。为更好研究该基因及其编码蛋白,通过分子生物学手段、以发菜基因组为模板,克隆钾通道蛋白编码基因Trk A-N序列,成功获得长度为696 bp的核酸序列。进行生物学信息分析结果表明,钾离子通道蛋白Trk A-N平均分子质量为31. 41 k Da,理论等电点为5. 82,该蛋白不含跨膜区,是亲水性蛋白。蛋白氨基酸序列中分别有10个Ser位点、6个Thr位点、2个Tyr位点,二级结构主要为α螺旋和β折叠。随后,将Trk A-N编码基因与诱导表达质粒p ET28a进行重组并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,最佳表达条件为培养10 h后待菌液OD600值达到0. 8时,添加终浓度为1 mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG),继续诱导20 h,最终在大肠杆菌中成功表达出分子质量为31. 41 k Da的蛋白。该研究为进一步阐明发菜响应盐胁迫的机制奠定一定的理论基础。

膜蛋白KCNN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化

目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。

甘蔗(Saccharum species hybrid)钾通道蛋白基因SsAKT1的克隆及对胁迫的响应

钾通道蛋白是植物吸收钾的主要途径之一。本研究利用RT-PCR技术从低钾胁迫的甘蔗根系中克隆得到钾通道蛋白基因,命名为SsAKT1,全长为3119bp,开放阅读框为2658bp,包含885个氨基酸。SsAKT1基因编码的蛋白与其他作物中AKT1基因具有高度的同源性,一致的氨基酸比例在61%~94%之间。该基因编码的蛋白具有6个跨膜结构域、中央孔道结构域、锚定蛋白结构域等AKT基因家族所具有的全部功能结构域,属于AKT家族。蛋白的进化树分析表明：SsAKT1与禾本科植物玉米、粟米、水稻等中的AKT1亲缘关系较近,而与双子叶植物中的AKT1关系较远。实时荧光定量PCR检测低钾、干旱及盐胁迫24h后基因表达的变化显示,SsAKT1基因在三种胁迫下,表达均上调,其中以盐胁迫对该基因表达影响最大。由此可见SsAKT1基因对甘蔗耐低钾、干旱、盐胁迫具有一定的作用。

KCNE2对胃癌细胞上皮间质转化和PI3K/AKT信号通路的影响

目的探讨钾离子通道蛋白家族成员2(KCNE2)在胃癌细胞增殖、迁移侵袭和上皮间质转化(EMT)中的作用及其对磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路的影响。方法采用GEPIA和UALCAN分析KCNE2在胃癌组织中的表达。收集胃癌肿瘤组织和胃癌细胞系(MKN-1、MKN-28、SGC-7901、MKN-45和MGC-803)用于检测KCNE2表达;采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存分析。将MKN-45和MGC-803细胞分为pcDNA3.1组(阴性对照)和pcDNA3.1-KCNE2组(KCNE2过表达),CCK-8、伤口愈合实验和Transwell小室实验评估细胞的增殖、迁移和侵袭情况,qPCR和Western blot检测波形蛋白、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)和磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(p-AKT)的表达。结果KCNE2在胃癌组织中表达下调,与胃癌分期、分级和淋巴结转移有关(P<0.05)。与GES-1细胞相比,KCNE2在胃癌细胞中低表达(P<0.05)。与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1-KCNE2组MKN-45和MGC-803细胞的增殖、伤口愈合率、侵袭细胞数和EMT过程均受到抑制(P<0.05)。另外,pcDNA3.1-KCNE2组MKN-45和MGC-803细胞中p-PI3K和p-AKT表达较pcDNA3.1组降低(P<0.05)。结论KCNE2可作为肿瘤抑制因子,下调PI3K/AKT信号通路活性,抑制胃癌EMT过程以及细胞增殖和转移。

瑞芬太尼下调大鼠背根神经节和脊髓背角GIRK 2的表达

【目的】观察G蛋白门控内向整流钾离子通道亚单位2(GIRK2)在瑞芬太尼诱导的痛觉过敏大鼠背根神经节和脊髓背角中的表达和分布的变化。【方法】成年雄性SD大鼠尾静脉输注瑞芬太尼4μg/(kg·min)2 h建立痛觉过敏模型。瑞芬太尼注射后6 h、1 d、3 d和5 d,采用免疫荧光化学法观察GIRK2在瑞芬太尼诱导痛觉过敏大鼠的背根神经节(DRG)和脊髓背角中分布的变化。采用免疫印迹法检测大鼠背根神经节和脊髓背角GIRK2总蛋白和膜蛋白的表达。最后,采用行为学评价瑞芬太尼输注后,鞘内注射GIRK2特异性激动剂ML297对痛阈的影响。【结果】免疫荧光结果显示,在背根神经节和脊髓背角I-II板层,GIRK2主要与IB4阳性的小神经元及其神经纤维共定位,而瑞芬太尼注射后GIRK2表达显著降低。免疫印迹结果显示,静脉输注瑞芬太尼1 d后,与对照组相比,背根神经节GIRK2总蛋白(0.47±0.10 vs.1.01±0.17,P<0.001)和膜蛋白(0.47±0.11 vs.1.06±0.12,P<0.001)表达水平均显著减少;与背根神经节结果相一致的是,脊髓背角GIRK2总蛋白水平(0.52±0.09 vs.1.10±0.08,P<0.001)和膜蛋白表达水平(0.54±0.10 vs.1.01±0.13,P<0.001)也显著降低。行为学结果显示,与生理盐水组相比,在瑞芬太尼处理大鼠,ML297延长热撤足潜伏期的作用显著降低(P<0.001)。【结论】持续静脉输注瑞芬太尼可能通过诱导大鼠背根神经节和脊髓背角GIRK2表达下调诱发痛觉过敏。