铁抑素-1对糖尿病中晚期小鼠肝肾组织的保护作用

糖尿病是一种发病率高且并发症多的代谢性疾病,其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)占比较大。目前研究表明,T2DM伴随着肝、肾等脏器损伤引起并发症,严重危害人体健康。铁死亡通过芬顿反应产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS累积会激活缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α),从而引发血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平升高,铁死亡抑制剂——铁抑素-1(ferrostatin-1,Fer-1)具有强抗氧化能力,所以基于缺氧诱导因子-1α/血管内皮生长因子(HIF-1α/VEGF)信号通路,探讨Fer-1对糖尿病中晚期小鼠肝、肾组织的保护作用。实验以21~22周龄db/db小鼠作为糖尿病中晚期模型,铁死亡抑制剂Fer-1为干预药物。db/m小鼠为空白对照组,连续4周测量体重、血糖,实验中还对各组小鼠进食量、饮水量进行记录;测定血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平,测定肝肾组织中ROS、谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性以及尿蛋白含量,并用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色处理肝、肾组织切片,光镜观察病理学形态,再通过Western印迹法分别检测肝、肾组织中HIF-1α、VEGF和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白质水平。在db/db组小鼠中发现,Fer-1(1 mg·kg^(-1),ig)可明显减少进食量和饮水量,降低小鼠血清中的ALT、AST水平、肝肾组织中ROS生成量以及尿蛋白水平,显著升高GSH活性,显著改善了肝、肾的病理组织状况,并且明显抑制肝肾组织中HIF-1α和VEGF蛋白质指标、提高GPX4蛋白水平。Fer-1虽不能改变糖尿病小鼠的体重和降低血糖,但能对糖尿病中晚期小鼠的肝、肾组织发挥保护作用,其作用机制可能与HIF-1α/VEGF和GPX4有关。

铁抑素-1抑制血红素诱导的小鼠海马神经元铁死亡

目的:研究铁抑素-1(Fer-1)对血红素诱导的小鼠海马神经元铁死亡的影响。方法:小鼠海马神经元细胞系HT22细胞分为对照组(control)、血红素处理组(hemin)以及血红素和铁抑素-1联合处理组(hemin+Fer1)。利用CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性,利用活性氧荧光探针(DCFH-DA)法检测各组细胞中反应性活性氧(ROS)的含量,利用商品化试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)的含量,利用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(MMP)变化,利用Western Blot和real time RT-PCR检测细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达。结果:血红素处理可降低HT22细胞活性,诱发氧化应激,破坏线粒体膜电位(MMP),并下调GPX4表达而诱导铁死亡。相反,Fer-1可以使细胞活性恢复,降低氧化应激反应,从而抑制HT22细胞铁死亡。结论:血红素中诱发了HT22细胞内脂质过氧化反应,引起线粒体损伤及铁死亡;铁死亡抑制剂Fer-1可以阻断血红素这种细胞毒性。

小胶质细胞铁死亡在烟雾吸入性脑损伤中的作用机制探讨

目的探究小胶质细胞铁死亡在烟雾吸入性脑损伤中的作用机制。方法将20只C57BL/6小鼠随机分为对照组(Control组)、烟雾吸入性损伤(SII)组、铁抑素治疗组(Fer-1组,2.5 mmol/kg Fer-1)、甲磺酸去铁胺治疗组(DFO组,200 mg/kg DFO),每组5只。Fer-1组和DFO组于造模后第1、3、5天分别腹腔注射Fer-1和DFO。第6天通过苏木素伊红(HE)染色、普鲁士蓝染色观察各组小鼠脑组织的病理变化。实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测脑损伤因子、炎性因子、铁死亡因子基因表达水平。双联吡啶比色法测定小鼠脑组织中铁含量。硫代巴比妥酸比色法测定小鼠脑组织脂质过氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)含量。黄嘌呤氧化酶法测定小鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性。二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)直接法测定小鼠脑组织谷胱甘肽(GSH)含量。DMEM完全培养基培养BV2细胞,分为Control组、Erastin组(10μmol/L Erastin刺激)、Fer-1组(10μmol/L Erastin与5 mmol/L Fer-1同时刺激)、DFO组(10μmol/L Erastin与50 mmol/L DFO同时刺激)。24 h后,CCK-8法检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况,2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA)检测细胞内活性氧(ROS)水平,线粒体红色荧光探针检测线粒体膜电位。结果与Control组相比,SII组小鼠脑组织出现明显铁沉积和炎症反应,脑组织脑损伤因子、炎性因子mRNA表达水平升高,乙酰辅酶A合成酶长链家族4(ACSL4)、核受体共激活因子4(NCOA4)mRNA表达水平升高,谷胱甘肽氧化酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)mRNA表达水平降低,小鼠脑组织GSH和SOD含量降低,LPO和MDA含量升高(P<0.05)。与SII组相比,Fer-1组和DFO组小鼠相应指标变化与上述相反(P<0.05),小鼠脑组织损伤减轻。BV2细胞实验结果显示,与Control组相比,Erastin组BV2细胞存活率下降、凋亡率升高(P<0.05),细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位下降;与Erastin组相比,Fer-1组、DFO组细胞相应指标变化与上述相反(P<0.05),BV2细胞氧化损伤得到缓解。结论铁死亡抑制剂Fer-1和DFO能够抑制小胶质细胞铁死亡并缓解烟雾吸入性脑损伤。

抑制铁死亡改善血管性痴呆大鼠认知功能的作用与机制研究

目的研究血管性痴呆(VD)中铁死亡的作用与机制。方法选取36只体质量200~220 g的健康雄性SD大鼠,采用随机数字表法将大鼠分为3组:(1)假手术组:仅分离但不结扎血管;(2)VD组:采用改良双侧颈总动脉永久结扎法制作VD模型大鼠;(3)Ferrostatin-1(Fer-1)组:制备VD模型大鼠后,予以特异性铁死亡抑制剂Fer-1腹腔内注射。VD模型造模成功1个月后,通过Morris水迷宫试验评价大鼠的认知功能,采用尼氏染色观察大鼠海马病理改变,使用Perls’铁染色检测海马铁沉积情况,电镜下观察大鼠海马CA1区神经元超微结构,应用RT-PCR检测大鼠海马前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)mRNA的表达水平,使用ELISA法检测海马丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的表达水平,运用Western blot检测海马4-羟基壬烯醛(4-HNE)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达水平。结果与假手术组相比,VD模型大鼠逃逸潜伏期延长(P<0.05),跨越平台次数及靶象限停留时间均减少(P<0.05),大鼠海马CA1区神经元数量减少(P<0.05),神经元线粒体皱缩,铁沉积增多(P<0.05);海马PTGS2 mRNA表达增多(P<0.05),GSH及GPX4表达下调(P<0.05),MDA及4-HNE表达增多(P<0.05)。与VD模型大鼠相比,腹腔注射Fer-1后大鼠认知功能显著改善,海马CA1区神经元数量增多(P<0.05),铁沉积减少(P<0.05);海马PTGS2 mRNA表达增加(P<0.05),GPX4和GSH表达上调(P<0.05),4-HNE和MDA表达下调(P<0.05)。结论铁死亡参与VD的发生发展,Fer-1通过减少铁沉积、增强抗氧化能力及减少脂质过氧化物堆积等抑制海马神经元铁死亡,改善VD模型大鼠的认知功能。

热疗调控铁死亡通路对舌鳞癌细胞生物学行为影响的研究

目的探讨热疗(HT)对舌鳞癌细胞系CAL-27铁死亡的调控作用和可能机制。方法采用CCK-8法检测铁死亡抑制剂Fer-1的半抑制浓度(IC50)并用于后续实验。CAL-27细胞系按实验设计分为HT组、对照组、Fer-1组以及HT+Fer-1组。采用各自检测试剂盒检测活性氧水平、铁离子浓度,采用实时反转录PCR检测p53、转铁蛋白受体1(TfR1)的mRNA水平,细胞划痕法检测细胞迁移,流式细胞术检测细胞凋亡。结果热疗组CAL-27细胞系活性氧水平(P<0.01)和铁离子浓度(P<0.001)显著上调,p53及TfR1的mRNA表达量也明显增加(P值均<0.01),细胞迁移能力下降(P<0.001),凋亡率升高(P<0.01)。HT+Fer-1组与HT组相比活性氧水平(P<0.001)、铁离子浓度(P<0.001)、p53及TfR1的mRNA表达量均降低(P值均<0.01),细胞迁移能力恢复(P<0.01),凋亡率也降低(P<0.01)。结论热疗可能通过激活p53/TfR1通路诱导舌鳞癌细胞系CAL-27铁死亡,抑制其迁移能力并促进其凋亡。