高等植物铁氧还蛋白的结构与功能

该文介绍了高等植物中铁氧还蛋白(Fd)的结构,铁氧还蛋白与铁氧还蛋白:NADP+氧化还原酶(FNR)的相互作用,氧化还原电势和电子传递活性;阐述了铁氧还蛋白结构与功能的关系。

一种新的阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因(英文)

目的铁氧还蛋白系铁硫蛋白,在多种反应体系中起着传递电子的作用,也参与抗滴虫药物甲硝咪唑杀虫作用的激活。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因,以便进一步探讨其生理功能。方法构建阴道毛滴虫cDNA表达文库,分离cDNA进行克隆、测序及序列分析。结果在分离出的cDNA克隆中发现一个新的铁氧还蛋白基因。该基因读码框全长312bp,相应蛋白质序列具103个氨基酸;在该蛋白质前体的N端带有10个氨基酸残基的氢酶体靶片段(MLSQCSPLRF)。序列分析显示该铁氧还蛋白(TvFd2)与已报道的阴道毛滴虫铁氧还蛋白(TvFd)有高度同源性(69%);TvFd2与铁氧还蛋白(2Fe-2S)的两大亚类(氧化酶铁氧还蛋白和光合铁氧还蛋白)均具较低的同源性;可与(2Fe-2S)结合的4个半胱氨酸排列成典型的铁氧还蛋白保守序列(-C-X5-C-X2-C-Xn-C-)。结论分析表明TvFd2是一新的阴道毛滴虫铁氧还蛋白,其功能有待进一步研究。

文心兰转化龙眼不同类型铁氧还蛋白基因提高抗病作用分析

以含5mg·L-1潮霉素MS培养基进行抗性筛选培养,以EHA105农杆菌介异,将龙眼2个非光合铁氧还蛋白基因导入文心兰,结果表明,所获Fd3转化植株表现更高的移栽成活率和对抗病害的能力。与野生型植株相比,Fd3转化植株抵抗软腐病能力提高,由高感软腐病(Di=100)提升为中抗软腐病(Di=27.5),移栽成活率由79.3%提高至95.7%,均达极显著差异水平。

拟南芥铁氧还蛋白基因缺失促进花期提前的初步研究(英文)

拟南芥的红光/远红光受体光敏色素(PHYs)参与花期调节过程,而铁氧还蛋白色素还原酶(FD-BRs)的一种——植物色素合成酶(HY2)对于光敏色素的合成是必不可少的。研究发现拟南芥铁氧还蛋白——AtFd2的基因缺失突变体(Fd2-KO突变体)在长日照与短日照培养条件下,较其野生型而言均表现出花期提前的表型,而且显示AtFd2与AtHY2在叶绿体中发生互作,并且Fd2突变体对光敏色素的反应受到抑制。推测At-Fd2基因的缺失可能通过影响光敏色素介导的相关生理功能进而对植株的花期进行调节。

结核分枝杆菌铁氧还蛋白还原酶FdrA和FprA在CYP125A1的电子传递链中的作用分析

目的体外评价结核分枝杆菌(Mtb)铁氧还蛋白还原酶FdrA和FprA的活性,探索它们分别与两种铁氧还蛋白的偶联作用,并分析它们在CYP125A1的电子传递链中的作用。方法采用大肠杆菌作为宿主克隆结核分枝杆菌FdrA、FprA和CYP125A1编码基因并进行蛋白外源表达;以NADH或NADPH为电子供体,2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)为电子受体评价FdrA及FprA的活性;应用细胞色素C为电子受体研究FdrA或FprA与不同铁氧还蛋白的偶联作用;分析CYP125A1对4-胆甾烯-3-酮的代谢作用进而研究FdrA和FprA在CYP125A1的电子传递链中的作用。结果 FdrA对NADH亲和力较高,Fdx对FdrA活性有明显提升作用,菠菜铁氧还蛋白(spFDX)对其活性没有提升作用,FdrA/Fdx和FdrA/spFDX均不能支持CYP125A1的活性。FprA对NAPDH亲和力较高,Fdx和spFDX均对FprA活性有明显提升作用,Fdx尤甚,FprA/spFDX可以支持CYP125A1的活性,FprA/Fdx不能支持CYP125A1的活性。结论 FprA是结核分枝杆菌CYP125A1的电子传递链蛋白,FdrA可能不是CYP125A1的电子传递链蛋白。

普通烟草铁氧还蛋白Ⅰ的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-Ⅰ)原核表达载体,表达可溶性Fdn-Ⅰ蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-Ⅰ在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-Ⅰ全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-Ⅰ,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-Ⅰ与GST融合表达载体pEGX-Fdn-Ⅰ,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-Ⅰ可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-Ⅰ蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-Ⅰ的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3mmol·L-1条件下表达出大小为41.3kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-Ⅰ的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-Ⅰ在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-Ⅰ大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-Ⅰ的表达。

阴道毛滴虫铁氧还蛋白与甲硝唑抵抗的研究进展

氢化酶体是阴道毛滴虫重要的代谢器官,该器官内存在的铁氧还蛋白不仅是虫体代谢过程中主要的电子传递介体,而且也在甲硝唑的激活中起关键作用。近年来阴道毛滴虫的甲硝唑抵抗株在临床和实验室都有报道,实验研究发现活化药物的铁氧还蛋白减少或缺失,因此对铁氧还蛋白与甲硝唑抵抗的相关性研究越来越受到医学及药学界的重视。本文总结近年来该领域的研究成果及发展动态,以期对滴虫药物抵抗的发生机制以及滴虫病防治的研究提供有价值的资料。

Clostridium ljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因插入失活载体的构建

合成气/富CO废气发酵制乙醇是一项新的乙醇生产技术。该技术能以生物质、有机废物气化产生的合成气(主要成分CO,CO2和H2)或炼钢厂的废气为原料,利用特殊的微生物将其发酵为乙醇,因而在生物质、富CO废气及一些有毒或难降解的有机废物利用上将发挥重要作用。Clostridium ljungdahlii是最早发现也是研究得最多的合成气乙醇发酵菌株,其全基因组序列已报道。乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶是Clostridiumljungdahlii乙醇合成过程中催化乙酸/乙醛转化的一个重要的酶。本研究根据Clostridium ljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因序列设计了Ⅱ型内含子插入识别位点及相关引物,其最适插入位点为基因的有义链第360与361位核苷酸之间,之后采用重叠延伸PCR法扩增了内含子的IBS,EBS1d和EBS2序列,在质粒pMTL007的基础上构建了用于Clostridium ljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因插入失活的质粒pMTL007-Clj-aor-360s,经酶切和DNA测序验证,再转化含质粒pMCljS的大肠杆菌E.coli XL1-blue,利用氯霉素和奇霉素双抗性筛选获得了经甲基化修饰的目的质粒,可用于下一步电转化Clostridium ljungdahlii以构建Clostridiumljungdahlii乙醛铁氧还蛋白氧化还原酶基因失活的基因工程菌。

高等植物铁氧还蛋白的结构装配和基因表达调控的研究进展

本文综述高等植物铁氧还蛋白的结构和装配研究近况,并着重讨论其基因克隆和表达调控方面的最新进展。

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因真核表达质粒的构建

作者用螯合树脂(Chelex-100)提取阴道毛滴虫基因组DNA,PCR扩增出阴道毛滴虫铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因,克隆入pMD-18T载体,亚克隆至pcDNA3·1(+)真核表达质粒。经PCR及酶切鉴定,Fd基因体外扩增产物为306bp,与已知序列吻合。成功构建了Fd基因的真核表达质粒。

甘蔗铁氧还蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以甘蔗叶片总RNA为模板，通过RT—PCR扩增铁氧还蛋白（ferredoxin．Fd）基因的cDNA，构建到pMDl8一T载体后进行序列测定和序列分析。结果表明：①克隆得到的cDNA片段长度为688bp，包含甘蔗刚基因完整的开放读码框，编码151个氨基酸。其中酸性氨基酸残基较多，76-101的氨基酸序列高度保守；②甘蔗与玉米刚基因cDNA序列的同源性为93．68％．氨基酸序列同源性为95-39％：③该基因推导的蛋白分子量大小为16．05ku，理论等电点为4．72，疏水性分值在-2．567．1．344之间，蛋白二级结构中，α-螺旋占13．9％，β-折叠占25．8％．无规则卷曲占60.3％。将得到的序列命名为肘1．GenBank登录号为GU320210．1。

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的原核表达

目的在原核细胞中表达阴道毛滴虫铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因。方法构建阴道毛滴虫Fd基因的原核表达重组质粒pUC19-Fd,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。结果经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)分析,重组质粒在大肠埃希菌中表达出Fd。结论在大肠埃希菌中表达出了Fd。

利用微型计算机分子图形技术显示铁氧还蛋白的分子结构

我们利用微型计算机图形技术对两种铁氧还蛋白的分子结构进行了研究,输入蛋白晶体数据,重构出铁氧还蛋白分子的三维结构模型,并可使之统X轴、Y轴和Z轴旋转;计算出肽链上原子之间的健长、健角、(?)角:显示微区结构;进一步可使两个铁氧还蛋白的三维结构图叠合,(?)利比较分析.实验表明,微型计算机分子图开技术在研究蛋白质等生物大分子结构,运动及中与功能的关系方面是有效的工具;

铁氧还蛋白：硫氧还蛋白还原酶的分离纯化

铁氧还蛋白：硫氧还蛋白还原酶（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ：ＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎＲｅｄｕｃｔａｓｅ，简称ＦＴＲ）是植物光合作用调控系统中的一个关键酶。本研究利用菠菜叶片，通过ＳｙｐｈａｄｅｘＧ—２５Ｆ过滤柱和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００ＨＲ凝胶过滤柱层析，然后再经Ｑ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析，最后通过羟磷灰石色谱柱纯化，分离纯化了ＦＴＲ。

玉米叶绿体铁氧还蛋白1的原核表达及部分性质分析

叶绿体铁氧还蛋白(Fd)通过活性中心的铁硫簇传递还原力,在各种氧化还原途径中起重要作用。本研究中,氨基酸序列比对显示玉米中5种Fd的叶绿体导肽同源性很低,而去除导肽的成熟蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。采用RT-PCR技术从玉米幼叶总RNA中克隆了编码成熟Fd1的基因,并分别插入pQE 80和p28SUMO表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的N端含有组氨酸标签的Fd1(His-Fd1),和含有组氨酸标签的小类泛素修饰蛋白(SUMO)的Fd1(HisSUMO-Fd1),用Ni-NTA层析介质亲和纯化,SDS-PAGE显示纯化的His-Fd1为一条带,亚基分子量约12kD。纯化的HisSUMO-Fd1用专一性蛋白酶Ulp除去HisSUMO,获得纯化的Fd1。紫外可见光谱扫描显示纯化的HisSUMO-Fd1溶液在315nm、415nm和459nm有特异吸收峰,电子顺磁共振波谱分析表明Fd1中存在[2Fe-2S]。SDS-PAGE显示多种玉米幼叶可溶性蛋白被固定化的His-Fd1吸附。

菠菜铁氧还蛋白的简易分离方法

用DEAE纤维素 (DE 5 2 )从菠菜叶片的抽提液中吸附蛋白 ,再以NaCl分级洗脱得到含铁氧还蛋白 (Fd)的分部。

利用NCI-H1975细胞筛选对奥西替尼耐药的铁氧还蛋白1基因及其功能鉴定

目的利用非小细胞肺癌细胞研究对奥西替尼潜在耐药基因及其分子机制。方法首先利用CRISPR-Cas9全基因组文库在人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975中筛选奥西替尼潜在耐药基因,并且分别敲除潜在耐药基因铁氧还蛋白1(FDX1)和一个对照基因腺相关病毒整合位点1(AAVS1),建立敲除了FDX1和AAVS1稳定细胞,简称sg-FDX1细胞和sg-AAVS1细胞。提取sg-FDX1细胞基因组并且PCR扩增出sgRNA序列两侧的DNA序列,连接到T载体后进行测序;Western印迹法检测sg-FDX1和sg-AAVS1细胞中FDX1蛋白表达水平;将构建的sg-FDX1和sg-AAVS1细胞分别与奥西替尼0,30,50和100 nmol·L-1培养30 h,Western印迹法检测细胞中切割后的聚(ADP-核糖)聚合酶(c-PARP)蛋白表达水平,表皮生长因子受体(EGFR)和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平。采用平板克隆实验,当克隆生长到约为10个细胞时加入奥西替尼12 nmol·L-1作用10 d,显微镜下计数≥10个细胞的克隆数;细胞用奥西替尼0~30 nmol·L-1作用72 h,或30 nmol·L-1作用3,5和7 d后,CCK8法检测肿瘤细胞的存活率。结果测序结果表明,sg-FDX1细胞中的FDX1基因发生缺失,同时FDX1在蛋白表达水平被有效敲除;和sg-AAVS1细胞相比,奥西替尼50 nmol·L-1处理的sg-FDX1细胞中c-PARP表达水平显著降低(P<0.01);奥西替尼在sg-FDX1细胞中对EGFR和ERK蛋白磷酸化表达抑制作用相对于sg-AAVS1细胞显著降低(P<0.01)。克隆形成和CCK8实验表明,相对于sg-AAVS1细胞,奥西替尼对sg-FDX1细胞的克隆形成率和增殖抑制作用显著降低(P<0.05)。结论 NCI-H1975细胞敲除FDX1,减弱了奥西替尼诱导细胞凋亡功能,可能是FDX1参与NCI-H1975细胞对奥西替尼耐药机制之一。

集胞藻PCC 6803类铁氧还蛋白Slr1205的功能研究

类铁氧还蛋白(ferredoxin-like,Fd-like)在高等植物中具有调控叶绿体发育等多种重要的生理功能,但在蓝藻中的生物功能尚未被发现。通过比较集胞藻PCC 6083编码Fd-like蛋白基因的敲除突变株Δslr 1205与野生型(WT)在不同碳源和光周期条件下的生理生化表型,分析Slr1205在集胞藻中的功能。结果显示,在高CO 2浓度自养、混合营养和光异养时,Δslr 1205的生长速率低于WT,而在空气中自养条件下并无差异。与此相对应,混合营养和光异养时Δslr 1205比WT的呼吸速率低,与呼吸作用密切相关的NDH-1L复合体的含量少。Δslr 1205在所有测试的条件下有较高的类胡萝卜素以及偏黄的表型。这些数据表明,Fd-like蛋白Slr1205的缺失造成在碳源充足条件下的生长速率下降,这可能是由于呼吸作用下调导致供能不足。研究结果为今后深入研究蓝藻Fd-like蛋白奠定了基础,为开展光合作用和呼吸作用的调节机制研究探索了新方向。

人铁氧还蛋白表达载体构建

目的为了将人铁氧还蛋白(adrenodoxin,FDX)在293T细胞中表达,扩增FDX的ORF,将FDX的ORF插入到哺乳动物细胞表达载体pcDNA的NotI/KpnI,构建表达载体。方法以GeneBank报道的FDX的mRNA序列(NM_004109.5)为模板设计引物,在5'和3'分别引入限制性酶切位点NotI和KpnI,从HepG2的cDNA中扩增FDX的ORF,将FDX的PCR产物和空载体pcDNA3.1用NotI和KpnI双酶切4 h,酶切产物用DNA回收试剂盒回收。将FDX的PCR酶切产物分别连接到空载体NotI/KpnI,连接产物转化DH5α,培养过夜。挑单克隆,用PCR鉴定阳性克隆并测序。结果经1%琼脂糖凝胶电泳和EB染色,观察到一500 bp条带,阳性克隆的测序结果与GeneBank报道的核酸序列一致。结论应用常规分子克隆方法已成功构建了FDX的真核表达载体pcDNA-FDX。

葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-PcyA的克隆、表达及其分子结构基础

为研究葛仙米藻蓝胆素的细胞内合成作用,采用聚合酶链式反应(PCR)、构建融合His标签重组载体和SDS-PAGE电泳等试验方法,克隆与表达葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-PcyA,并对其蛋白高级结构进行模拟分析。结果显示,葛仙米藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因Ns-PcyA密码区全长744 bp,预测编码一含247个氨基酸的蛋白质肽链。Ns-PcyA与同属其他藻种中的同源蛋白氨基酸序列总相似性可达95.66%,并且富含半胱氨酸(7个Cysteine残基)。以点型念珠藻(Nostoc punctiforme)为参照,葛仙米Ns-PcyA蛋白多肽链除C末端多两个氨基酸外,还出现8个位点氨基酸的显著替换;分子进化显示,Ns-PcyA很可能源于点型念珠藻的同源基因,而与发状念珠藻和普通念珠藻中PcyA基因形成明显分支。这表明PcyA基因的生物学功能在不同念珠藻中可能产生变异。构建Ns-PcyA基因的重组表达载体,并在大肠杆菌中成功表达分子量近29.0 ku的目的蛋白。高级结构模拟显示,Ns-PcyA单分子中主要包含α螺旋和β折叠片两类二级结构,α螺旋和β折叠片进一步形成类似三面夹心式高级结构。其外围两侧共分布5个较典型的α螺旋,而8个反向平行β折叠片夹于其中,形成一疏水内核。本研究结果为深入了解和开发葛仙米藻蓝胆素的细胞内合成作用奠定了试验基础。