利用NCI-H1975细胞筛选对奥西替尼耐药的铁氧还蛋白1基因及其功能鉴定

目的利用非小细胞肺癌细胞研究对奥西替尼潜在耐药基因及其分子机制。方法首先利用CRISPR-Cas9全基因组文库在人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975中筛选奥西替尼潜在耐药基因,并且分别敲除潜在耐药基因铁氧还蛋白1(FDX1)和一个对照基因腺相关病毒整合位点1(AAVS1),建立敲除了FDX1和AAVS1稳定细胞,简称sg-FDX1细胞和sg-AAVS1细胞。提取sg-FDX1细胞基因组并且PCR扩增出sgRNA序列两侧的DNA序列,连接到T载体后进行测序;Western印迹法检测sg-FDX1和sg-AAVS1细胞中FDX1蛋白表达水平;将构建的sg-FDX1和sg-AAVS1细胞分别与奥西替尼0,30,50和100 nmol·L-1培养30 h,Western印迹法检测细胞中切割后的聚(ADP-核糖)聚合酶(c-PARP)蛋白表达水平,表皮生长因子受体(EGFR)和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平。采用平板克隆实验,当克隆生长到约为10个细胞时加入奥西替尼12 nmol·L-1作用10 d,显微镜下计数≥10个细胞的克隆数;细胞用奥西替尼0~30 nmol·L-1作用72 h,或30 nmol·L-1作用3,5和7 d后,CCK8法检测肿瘤细胞的存活率。结果测序结果表明,sg-FDX1细胞中的FDX1基因发生缺失,同时FDX1在蛋白表达水平被有效敲除;和sg-AAVS1细胞相比,奥西替尼50 nmol·L-1处理的sg-FDX1细胞中c-PARP表达水平显著降低(P<0.01);奥西替尼在sg-FDX1细胞中对EGFR和ERK蛋白磷酸化表达抑制作用相对于sg-AAVS1细胞显著降低(P<0.01)。克隆形成和CCK8实验表明,相对于sg-AAVS1细胞,奥西替尼对sg-FDX1细胞的克隆形成率和增殖抑制作用显著降低(P<0.05)。结论 NCI-H1975细胞敲除FDX1,减弱了奥西替尼诱导细胞凋亡功能,可能是FDX1参与NCI-H1975细胞对奥西替尼耐药机制之一。

铁氧还蛋白1在肿瘤免疫和治疗预后中的研究进展

铁氧还蛋白1(FDX1)是铜死亡(cuproptosis)的关键调控基因,参与肿瘤细胞和免疫微环境中多种代谢过程,在肿瘤治疗和生存预后等方面发挥着重要作用。本综述通过研究FDX1影响细胞发生铜死亡的功能和分子机制,分析FDX1与泛癌中患者生存预后关系、FDX1与肿瘤免疫和药物敏感性的联系,发现FDX1参与调控线粒体功能、调节肿瘤细胞内铜离子平衡、影响肿瘤细胞铜死亡,并且FDX1与肿瘤患者的预后、免疫细胞浸润、肿瘤免疫应答和肿瘤耐药紧密相关。因此,FDX1可为开发肿瘤新的潜在治疗靶点、免疫治疗反应的指标和预后标志物提供新的思路。

铜死亡诱导剂FDX1、硫辛酸与冠状动脉病变严重程度的相关性

目的分析铜死亡诱导剂铁氧还蛋白1(FDX1)、硫辛酸(LA)与冠状动脉粥样硬化发病以及不同病变程度之间的相关性,探讨二者在冠心病(CHD)发生、发展中的变化规律。方法选取冠脉造影(CAG)提示冠脉病变患者和CAG正常患者,其中冠脉病变患者按照冠脉狭窄严重程度分成轻度狭窄组(a-CHD组)、中度狭窄组(b-CHD组)和严重狭窄组(c-CHD组)。通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同冠脉狭窄患者和正常患者血清FDX1、LA水平。以ApoE-/-小鼠为高脂血症小鼠模型,通过HE染色检测正常小鼠和模型小鼠主动脉病理形态学变化;天狼猩红染色观察胶原纤维沉积情况;免疫组化检测主动脉FDX1、LA的表达与分布,RT-PCR检测小鼠主动脉FDX1、硫辛酸合成酶(LIAS)和线粒体顺乌头酸酶(ACO_(2))mRNA表达。结果与对照组相比,a-CHD组、b-CHD组和c-CHD组血清FDX1、LA水平均明显降低(P<0.05,P<0.01),随着冠脉狭窄程度的加重血清FDX1、LA水平逐渐减低(P<0.01);随着冠脉病变支数的增加FDX1、LA逐渐下降(P<0.05,P<0.01);血清FDX1、LA水平与Gensini评分呈明显负相关关系(r=-0.241,P<0.01;r=-0.273,P<0.01),血清FDX1与LA呈正相关关系(r=0.451,P<0.01)。与正常小鼠相比,ApoE-/-模型组小鼠血脂水平明显上升(P<0.01),动脉粥样硬化(AS)指数明显增高,ApoE-/-模型组主动脉血管有增厚及脂质聚集、血管胶原纤维增生明显,FDX1、LA、LIAS、ACO_(2)表达均明显降低(P<0.05,P<0.001)。结论随着不同冠状动脉病变程度的加剧,血清FDX1、LA水平逐渐降低,且两者之间存在相关性,FDX1、LA的表达与高脂血症所致的血管病变有关。

铜死亡在脓毒症急性肝损伤中的作用

目的探讨铜死亡在脓毒症急性肝损伤中的作用。方法50只雄性C57BL/6J小鼠均分为盲肠结扎穿刺术诱导脓毒症组(CLP组,n=25)和假手术组(Sham组,n=25),术后24 h采集心脏血及分离肝组织,采用全自动生化分析仪检测2组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平,采用苏木精-伊红染色法(HE)染色观察2组小鼠肝脏组织的形态学特征,采用蛋白印迹法检测2组小鼠肝脏组织中铁氧还蛋白1(FDX1)、硫辛酸合成酶(LIAS)、二氢硫辛酸转乙酰基酶(DLAT)、二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(DLST)、琥珀酸脱氢酶B(SDHB)、硫辛酰化DLAT(Lip-DLAT)、硫辛酰化DLST(Lip-DLST)蛋白的表达,采用免疫组织化学(IHC)技术检测2组小鼠肝脏组织中FDX1、Lip-DLAT及Lip-DLST的表达和定位情况;取对数生长期的人肝癌HepG2细胞,分为脂多糖(加50 mg/L脂多糖,刺激细胞24 h)组和空白对照组(不做任何处理),采用蛋白印迹法检测2组HepG2细胞中FDX1蛋白的表达。结果CLP组小鼠血清ALT、AST较Sham组均明显升高(P<0.01),HE染色可见CLP组小鼠肝细胞明显肿胀坏死,上述结果表明脓毒症导致急性肝损伤小鼠模型建立成功;CLP组小鼠肝脏组织中FDX1、LIAS、DLAT、DLST、SDHB、Lip-DLAT及Lip-DLST的表达较Sham组均降低(P<0.05),脂多糖组HepG2细胞中FDX1表达低于对照组(P<0.05);免疫组织化学染色显示,2组小鼠肝脏组织中FDX1、Lip-DLAT及Lip-DLST均主要表达于肝细胞的细胞质内,且CLP组小鼠肝组织中FDX1、Lip-DLAT及Lip-DLST表达均较Sham组减少(P<0.05)。结论在盲肠结扎穿刺术制作的脓毒症模型小鼠和脂多糖刺激的脓毒症细胞模型中,铜死亡参与了脓毒症急性肝损伤的发生发展过程。