铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠胃黏膜损伤及炎症反应的保护机制研究

研究铁皮石斛水溶性总蛋白对阿司匹林诱导大鼠胃黏膜损伤导致炎症的保护作用及相关机制。将Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、给药组。给药组灌胃铁皮石斛水溶性总蛋白(10、20 mg/kg)和奥美拉唑(3 mg/kg),5 d后灌胃阿司匹林300 mg/kg建立胃黏膜损伤模型。5 h后处死大鼠,测定胃黏膜损伤程度,血清中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量;胃组织中环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2,COX-2)、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA以及COX-2、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,Erk1/2)蛋白的表达。结果显示,铁皮石斛水溶性总蛋白能够有效降低阿司匹林造成的胃黏膜出血及糜烂,且能够使血清中PGE2、SOD含量有明显增加(p<0.01),IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量明显减少(p<0.01),胃组织中COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达量以及COX-2、pErk1/2与Erk1/2蛋白表达量的比值均有明显下调(p<0.01)。

基于拉曼光谱结合CNN-LSTM深度学习方法的铁皮石斛总黄酮含量快速检测研究

铁皮石斛具有很高的商业价值和营养价值,将云南文山、广西金秀、安徽霍山、浙江台州四个产地共130个样品作为研究样本,在785 nm激光下利用便携式拉曼光谱仪获得了铁皮石斛拉曼光谱,采用NaNO_(2)-Al(NO_(3))_(3)-NaOH比色法测定铁皮石斛总黄酮含量。以每条经过归一化后的拉曼光谱数据作为输入,利用Savitzky-Golay卷积平滑(SG平滑)、标准正态变量变换(SNV)、多元散射校正(MSC)等不同预处理方法对光谱数据进行处理,以偏最小二乘(PLS)、支持向量机(SVM)和卷积神经网络-长短期记忆神经网络(CNN-LSTM)模型作为比较,竞争自适应重加权采样(CARS)作为波长选择方法,对不同的机器学习模型进行比较研究。采用以下预测质量指标:校正集、测试集相关系数(R_(c)、R_(p)),校正集、测试集均方根误差(RMSEC、RMSEP),评价铁皮石斛总黄酮含量预测模型的性能。结果表明:光谱在经过SNV预处理之后,CNN-LSTM方法预测铁皮石斛总黄酮含量准确率最高,R_(c)、R_(p)分别为0.983和0.964,RMSEC、RMSEP分别为0.032和0.047 mg·g^(-1)。结合拉曼光谱建立的SNV-CNN-LSTM深度学习模型准确可靠,具有很强的鲁棒性,优于传统的机器学习模型(PLS、SVM)。利用拉曼光谱结合CNN-LSTM模型对铁皮石斛总黄酮含量进行预测,克服了传统的理化鉴别法的缺陷,具有快速无损的特点。该方法能对铁皮石斛的品质进行区分,并加快药食同源植物市场铁皮石斛产业化,构建自主品牌并增加其影响力,同时此项技术也可应用于消费者和市场监管部门。

铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化

【目的】探讨铁皮石斛多糖(DOP)对CCl4诱导肝纤维化(HF)的影响及其作用机制。【方法】将56只雄性SD大鼠随机分为七组:正常组(NG)、模型组(MG)、秋水仙碱组(CG,0.1mg/kg)、扶正化瘀组(FG,0.45g/kg)、低剂量DOP组(LDG,0.05 g/kg)、中剂量DOP组(MDG,0.1 g/kg)和高剂量DOP组(HDG,0.2 g/kg),每组8只。采用皮下注射40%CCl4橄榄油混合液制备HF大鼠模型,每3 d注射1次,共10周。造模第6周结束后,各药物组分别给予秋水仙碱、扶正化瘀和DOP溶液灌胃处理,NG和MG大鼠给予等量0.9%生理盐水处理,每天1次,连续4周。各组大鼠肝组织病理学采用苏木精-伊红(HE)、Masson染色、天狼星红(Sirius red)染色检测;肝功能和肝纤四项指标采用血液生化法检测;肝组织中α-SMA、Col-I、E-cadherin、ZEB1基因和蛋白的表达分别采用RT-qPCR法和Western Blot法检测。【结果】HE、Masson、Sirius red染色结果显示MG大鼠肝脏组织出现典型的HF病理特征,LDG、MDG和HDG大鼠HF均出现不同程度改善。肝功能检测结果显示,LDG、MDG、HDG大鼠的血清AST、TBIL、AKP水平与MG相比均显著降低(P<0.05或<0.01),血清ALT水平除LDG外均显著降低(P<0.05或<0.01)。肝纤四项指标检测结果显示,LDG、MDG、HDG大鼠的血清HA、LN、PC-Ⅲ、COL-Ⅳ含量与MG比较均明显下降(P<0.05或<0.01)。基因、蛋白检测结果显示,LDG、MDG、HDG大鼠肝组织中α-SMA、COL-I、ZEB1的相对表达量明显降低(P<0.05或<0.01),而E-cadherin的相对表达量升高(P<0.05或<0.01)。此外,HA、α-SMA、COL-I、ZEB1、E-cadherin的表达均存在一定的DOP剂量依赖性。【结论】DOP可通过抑制大鼠肝组织的上皮-间质转化减轻CCl4诱导的HF程度。

缺素及缺素恢复对铁皮石斛组培苗的影响

为探究12种必需矿质元素(包括N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo)对铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)生长及生理指标的影响,以铁皮石斛3个月组培苗为材料,以MS培养基为基础设置全营养对照(CK)、单一缺素处理和缺素恢复处理,分析各处理条件下铁皮石斛的表型特征和生理变化。结果显示:缺N、P、Ca、Cu、Zn处理组铁皮石斛组培苗缺素症状明显,整株的生长状态及叶片和假鳞茎的解剖结构均受到影响;除Zn外,其他元素缺素恢复处理后症状均得到明显改善。缺N、K、Ca、S、Zn处理组假鳞茎长及缺N、Ca处理组的叶片数受抑制明显。除P外,其他元素缺素处理组叶片叶绿素含量明显降低,多数缺素恢复处理组叶片叶绿素a和叶绿素b含量较缺素处理组极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)升高;缺Fe处理组的叶绿素a含量与叶绿素b含量的比值明显降低,恢复处理后接近于CK。除Fe外,其他微量元素缺素处理对叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性抑制明显,而缺大量元素处理组的SOD活性均不同程度升高;缺P处理组的过氧化物酶(POD)活性明显降低,而缺N、Mg、S、Mn、Zn、Cu处理组的POD活性明显升高,除Mn外,其他元素缺素恢复处理组的POD活性均升高。缺N、P可大幅提高叶片可溶性糖含量,缺N、Mn、Cu可大幅提高叶片可溶性蛋白质含量。缺N、Cu处理组假鳞茎多糖含量大幅高于CK,Ca、Mo缺素恢复处理组假鳞茎多糖含量较缺素处理组极显著升高;缺Mg处理组假鳞茎总黄酮含量大幅高于CK。综上,在保证铁皮石斛正常生长的前提下,可通过Ca、Mo缺素恢复处理来提高铁皮石斛假鳞茎多糖含量,通过适量缺Mg处理来提高铁皮石斛假鳞茎总黄酮含量。

铁皮石斛多糖的结构表征与抗氧化活性研究

为深入研究铁皮石斛多糖的抗氧化活性,以铁皮石斛为原料,提取纯化铁皮石斛多糖并表征其初步结构,从铁皮石斛多糖自由基清除能力和对低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)体外氧化抑制效果两个方面评价其抗氧化活性。结果表明,铁皮石斛多糖总糖含量90.17%±3.90%,蛋白质含量0.14%±0.05%,灰分含量4.47%±1.42%以及糖醛酸含量2.53%±1.02%,相对分子量23970 Da,单糖组成主要为甘露糖和葡萄糖。铁皮石斛多糖具有一定的自由基清除能力,可以抑制LDL氧化修饰体系中共轭二烯的产生,3.00 mg·mL^(−1)时铁皮石斛多糖对铜离子诱导的LDL氧化产生的硫代巴比妥酸反应产物(Thiobarbituric Acid Reactive Substances,TBARS)抑制率为57.46%±0.56%。本研究可为开发因LDL氧化导致的动脉粥样硬化(Arteriosclerosis,AS)等疾病药物提供理论支撑。

铁皮石斛碱溶性和水溶性多糖的比较研究

目的建立鲜铁皮石斛的碱溶性和水溶性多糖柱前衍生HPLC特征图谱,并初步比较其单糖组成及活性的差异。方法采用高效液相色谱法测定,比较铁皮石斛2种多糖的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-HPLC特征图谱、单糖的组成、相似度。应用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(WST-1法)测定2种多糖的抗氧化活性,根据其清除羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)的能力,评价其抗氧化活性。结果铁皮石斛水溶性多糖的单糖组成以D-甘露糖和D-葡萄糖为主;碱溶性多糖的单糖组成以D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-木糖为主。生物活性初步研究表明铁皮石斛碱溶性多糖和水溶性多糖均具有一定的抑制Hela细胞增殖的作用。铁皮石斛碱溶性多糖清除羟自由基(·OH)、过氧化氢(H_2O_2)的能力均强于水溶性多糖。结论铁皮石斛碱溶性和水溶性多糖的特征图谱、生物活性均有差异,而引起两者活性差异的原因可能跟单糖组成有关。

铁皮石斛多糖对慢性致痫大鼠学习记忆及海马Ng和PKC表达变化的影响

探讨铁皮石斛多糖对慢性致痫大鼠学习记忆及海马Ng和PKC表达变化的影响。方法 选取具备正常学习记忆功能的大鼠80只,随机数字表法分组,各20只,比较四组学习记忆及海马Ng和PKC表达水平。结果 相较于癫痫模型组,低剂量铁皮石斛多糖组与高剂量铁皮石斛多糖组的水迷宫学习记忆能力更高(P<0.05);四组逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05);相较于癫痫模型组,低剂量铁皮石斛多糖组与高剂量铁皮石斛多糖组的Y迷宫错误反应次数更少(P<0.05);四组全天总反应时间差异无统计学意义(P>0.05);相较于癫痫模型组,低剂量铁皮石斛多糖组与高剂量铁皮石斛多糖组的海马Ng和PKC表达水平更高(P<0.05);低剂量铁皮石斛多糖组、高剂量铁皮石斛多糖组与对照组的海马Ng和PKC表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 铁皮石斛多糖可使慢性致痫大鼠的学习记忆能力增强,作用机制可能为促使海马Ng和PKC表达提高。

不同生长龄铁皮石斛茎与叶中总多糖、总生物碱及总黄酮含量的差异

采用苯酚硫酸法、酸性染料比色法以及硝酸铝比色法分别测定并比较不同生长龄铁皮石斛茎与叶中总多糖、总生物碱及总黄酮的含量差异,为铁皮石斛资源的充分合理利用提供科学依据。结果表明,不同生长龄铁皮石斛茎与叶中总多糖、总生物碱、总黄酮的含量均有显著差异,其中总多糖主要集中于茎,总生物碱和总黄酮主要集中于叶;总多糖含量以2年龄茎最高,为35.32%,总生物碱含量以1年龄叶最高,为0.036%,总黄酮含量以半年生叶最佳,为0.104%;总多糖含量随着生长龄的增加而逐渐减少;3年龄以内的总生物碱和总黄酮含量明显较高,且不同龄之间含量差异较小,而当植株生长至4、5年龄时,其总生物碱及总黄酮的含量明显较低。铁皮石斛茎与叶中各含有较高的不同有效成分,茎和叶均可作为药用资源加以充分利用;为获取最佳效益,综合考虑生长周期、生物量及药用成分含量等因素,人工栽培的铁皮石斛以3年龄内采收为宜,不宜栽种4年以上。

铁皮石斛花总黄酮提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

[目的]确定铁皮石斛花中总黄酮超声辅助提取最佳工艺条件,并对其抗氧化活性进行评价。[方法]采用正交试验方法,以总黄酮提取率为考察指标,对铁皮石斛花总黄酮提取方法的影响因素进行探讨,并对铁皮石斛花总黄酮提取工艺进行优化。以羟自由基清除率、DPPH和ABTS自由基清除率为指标,对铁皮石斛花总黄酮的体外抗氧化活性进行评价。[结果]铁皮石斛花总黄酮的最佳提取条件:乙醇体积分数80%,料液比1:50,提取温度55℃,提取次数2次,在以上条件下,总黄酮提取率达1.99%。铁皮石斛花总黄酮对羟自由基、DPPH和ABTS自由基有较强的清除作用,且羟自由基抗氧化活性与总黄酮含量呈正相关。[结论]利用正交法分析结果可靠,得到了铁皮石斛花总黄酮超声提取的最佳工艺条件,且实验结果还表明铁皮石斛花具有较强的抗氧化活性。

乐清市铁皮石斛总黄酮含量的测定

[目的]测定乐清市铁皮石斛总黄酮的含量。[方法]以芦丁为对照品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色,在510 nm波长处用紫外分光光度法测定总黄酮的含量。[结果]芦丁在0.011 1～0.066 7 mg/ml浓度范围内与吸光度呈良好线性关系(R2=0.999 2);样品溶液在12 h之内稳定性良好,RSD值为0.15%;建立的方法重复性良好,其RSD值为3.12%。[结论]该方法简便、准确、稳定,可用于铁皮石斛中总黄酮含量的测定。

红外光谱结合化学计量学快速预测铁皮石斛中总黄酮含量

评价药用植物质量的主要手段之一是有效成分含量检测,不同采收期对药用植物有效成分含量有明显影响。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合化学计量学建立快速预测不同采收期铁皮石斛中总黄酮含量的方法,以期为铁皮石斛质量快速预测评价提供研究基础。采收2014年1至12月的铁皮石斛样品干燥粉碎;以氯化铝显色法测定铁皮石斛中总黄酮含量,分析不同采收时间铁皮石斛总黄酮的累积规律;采集样品红外光谱信息,归属红外吸收峰,拟合红外光谱数据和总黄酮含量数据,结合一阶导数、二阶导数、多元散射校正、标准正态变量、正交信号校正等对数据进行预处理,建立偏最小二乘回归模型预测样品中总黄酮含量。结果显示:(1)样品和标准品芦丁均在270nm附近有共有吸收峰,实验以270nm为总黄酮定量波长,标准曲线为y=6.076 5x+0.055 8,相关系数r=0.996 6,线性关系良好;重现性、精密度和稳定性相对标准偏差分别为1.00%,0.37%和0.28%,该方法稳定可靠;(2)总黄酮含量随时间变化趋势为先升高后降低,6月—8月样品含量较高,平均含量大于64.10mg·g^(-1);(3)铁皮石斛红外光谱数据与总黄酮含量拟合后进行一阶导数、二阶导数、多元散射校正、标准正态变量、正交信号校正等组合处理,用PLSR模型预测铁皮石斛的总黄酮含量,结果最佳预处理方式为2D+SG5+SNV+OSC-PLSR,训练集和验证集r分别为0.979 0和0.882 4,验证均方根误差(RMSEE)和预测均方根误差(RMSEP)分别为2.438 2和4.169 9,铁皮石斛中总黄酮含量预测值与测量值较接近,表明PLS模型可用于总黄酮含量的快速预测。傅里叶变换红外光谱结合化学计量学能实现铁皮石斛中总黄酮含量准确预测,为铁皮石斛质量评价提供快速、有效的方法。

响应面设计法优化铁皮石斛总多酚的提取工艺

利用响应面分析方法研究铁皮石斛总多酚的最佳提取工艺及体外抗氧化性。在选取酒精浓度、料液比、温度做单因素实验的基础上,进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合研究,建立了影响因素与总多酚之间的函数关系。获得最佳工艺条件为:乙醇浓度75%,料液比1∶40,提取温度75℃;在此最佳条件下水浴条件下浸提1 h,总多酚含量为28.01 mg/g,实验结果与模型预测值相符。铁皮石斛多酚提取物具有较强的清除对DPPH·和·OH自由基能力,其IC50(半抑制浓度)分别为526.872μg/m L和1263.024μg/m L。

藻蓝蛋白、铁皮石斛多糖及两者配伍对辐射损伤模型小鼠保护作用的研究

目的研究藻蓝蛋白、铁皮石斛多糖及两者配伍对辐射损伤模型小鼠的保护作用。方法 150只昆明雄性小鼠,随机分为正常对照组、模型对照组、藻蓝蛋白组、铁皮石斛多糖组、配伍治疗组,每组30只。灌胃给药,每日1次,连续30 d。除正常对照组外,其余组小鼠采用^(60)Coγ射线全身照射以复制辐射损伤模型。以小鼠30 d存活率和死亡小鼠平均存活时间、外周血白细胞数、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性为指标,研究蓝藻蛋白、铁皮石斛多糖及两者配伍对辐射损伤模型小鼠的保护作用。结果与正常对照组相比,模型对照组的30 d存活率明显下降,死亡小鼠平均生存时间也明显缩短。而与模型对照组比较,藻蓝蛋白组、铁皮石斛多糖组及配伍治疗组小鼠30 d存活率增高、死亡小鼠平均存活时间延长、外周白细胞计数增加、SOD活性与GSH-PX活性升高、MDA含量下降。肝脏和脾脏重量改变不明显。结论藻蓝蛋白、铁皮石斛多糖及两者配伍对辐射损伤模型小鼠均有一定保护作用,其中以蓝藻蛋白与铁皮石斛多糖配伍的防辐射作用最佳。

铁皮石斛类原球茎空气干燥法超低温保存中的脱水蛋白分析

用空气干燥法将铁皮石斛类原球茎脱水至不同含水量 ,进行超低温保存和热稳定蛋白的SDS PAGE分析 ,并进行脱水蛋白的Western blot检测。结果表明 :在本试验条件下 ,含水量以g/gDM表示时 ,铁皮石斛类原球茎脱水时间 (x)对含水量 (y)的回归方程式为y =- 0 12 0 8x +9 96 36。含水量下降为 0 1～ 0 5g/gDM时 ,冻后存活率达到最大值。当含水量达 1 0g/gDM时 ,热稳定蛋白的含量明显增加 ,经免疫检测其中分子量分别为 2 8 7和 34 3kD的两个热稳定蛋白为脱水蛋白。认为含水量是铁皮石斛超低温保存成功的关键因素 ,也是引起脱水蛋白大量积累的重要条件。

两种铁皮石斛总RNA提取方法的比较研究

铁皮石斛是我国重点保护药材,因其富含多糖及次生代谢物,用普通的方法难以从叶中提取到能满足构建全长cDNA文库等分子生物学实验对高质量RNA需要的总RNA。分别通过对异硫氰酸胍法和CTAB法进行改良。异硫氰酸胍法:往裂解液中加入PVP,通过PVP去除多酚;用56℃热水水浴5min加速组织细胞裂解;抽提时间由原来15 min缩短为5min;根据材料多糖多酚的多寡情况适当增加裂解液。CTAB法:根据材料多糖多酚的多寡情况适当增加CTAB裂解液;用LiCl对RNA进行选择性过夜沉淀;灵活处理,适当增大LiCl浓度。结果表明用改良后的2种方法均可提取到总RNA,经对比发现,改良CTAB法提取效果更好,可重复性强,抽取到的RNA更适合于后续的分子生物学实验。

8种产地铁皮石斛蛋白质和同工酶分析

研究可溶性蛋白和同工酶电泳图谱与铁皮石斛种质资源之间的关系。利用可溶性蛋白和同工酶电泳技术,对来自8个产地的8种铁皮石斛的可溶性蛋白、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳分析表明,8种铁皮石斛材料共得到119条谱带,特异性条带6条,多态性谱带占总谱带数的94.6%。在3种同工酶中,POD的谱带最为丰富,8种材料共得到36个条带;而PPO的谱带最少,8种材料只得到22个条带,说明其蛋白质和同工酶在种类和表达量上均有比较明显的差异。对8种铁皮石斛电泳条带进行的主成分分析表明,8种产地铁皮石斛的遗传变异不同,可分为4类。该研究对铁皮石斛的引种、育种具有指导意义。

铁皮石斛总RNA提取方法的比较研究

针对铁皮石斛富含多糖、多酚等次生代谢物质的特点,以铁皮石斛叶片为材料,比较改良CTAB-LiCl法、SDS法以及试剂盒法提取总RNA的质量,利用电泳检测、核酸蛋白仪浓度测定、RT-PCR等进行验证分析。结果表明,3种方法均能提取铁皮石斛叶片中总RNA,但提取效果存在差异。改良CTAB-LiCl法提取总RNA的28S和18S条带清晰、D_(600 nm)/D_(280 nm)与D_(260 nm)/D_(230 nm)分别为1.96和2.03,RNA完整性好、纯度高,RNA浓度在3种方法中最高,达到560.6 mg/L,RT-PCR扩增出目的基因片段条带最明显,适用于后续的分子生物学研究。

不同光照条件、不同采收时间对铁皮石斛总多糖、还原性糖以及甘露糖含量的影响

目的探讨不同采收时间和不同光照条件下铁皮石斛茎和叶中多糖、还原性糖以及甘露糖的动态变化规律。方法苯酚-浓硫酸法测定多糖含量,DNS法测定还原性糖含量,PMP柱前衍生化法测定甘露糖含量。结果铁皮石斛茎中多糖含量在单层遮阴网的条件下含量最高,而叶中多糖含量在全光照的条件下含量最高。叶中还原性糖含量远远高于茎中还原性糖含量。茎中甘露糖含量明显高于叶中甘露糖含量,但是叶中单糖组成较茎中丰富。结论不同的采收时间和光照强度对铁皮石斛的多糖、还原性糖和甘露糖的含量积累有一定影响,适宜的采收时间和光照强度对控制铁皮石斛药材的质量具有重要的实践意义。

铁皮石斛硫氧还蛋白基因(DoTrxL2)的克隆及表达分析

运用c DNA末端快速扩增技术(RACE)和巢式PCR技术克隆出铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因(Thioredoxin like 2,DoTrxL2)。序列分析表明DoTrxL2基因开放阅读框(ORF)长度为639 bp,编码213个氨基酸,编码产物含有一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC功能结构域,通过两个半胱氨酸的双硫键得失电子,起到氧化还原作用。分子进化分析显示,DoTrxL2同小兰屿蝴蝶兰、石刁柏亲缘关系较近。qRT-PCR分析显示,DoTrxL2在铁皮石斛原球茎不同发育时期及不同组织中均有表达差异,其中在原球茎形成早期表达量较高,表明该基因对原球茎形成有着促进作用;而在种子和花中表达量高,表明该基因对植物组织的生殖发育具有重要调控作用。

铁皮石斛生物总碱提取纯化研究

文章采用纤维素酶法提取铁皮石斛中的生物总碱，用离子交换树脂对铁皮石斛生物总碱进行了初步纯化，采用正交试验法优选石斛总碱的纯化条件。实验结果表明，离子交换树脂法最佳纯化条件为：上样速度为10mL／3h，洗脱液（氨水）浓度为1mol／L，洗脱速度为50mL／4h，生物总碱最佳收集段为洗脱液流出20～30mL时。本工艺操作简便，成本较低，值得进一步深入研究。