MicroRNA-133b调节FGFR1-ERK1/2-SOX2信号通路对裸鼠肺癌NCI-H1975细胞移植瘤生长的影响

目的探讨microRNA-133b(miR-133b)对裸鼠肺癌NCI-H1975细胞移植瘤生长的抑制作用以及对成纤维细胞生长因子受体1-细胞外信号调节激酶1/2-性别决定区Y-box蛋白2信号通路(FGFR1-ERK1/2-SOX2)的影响。方法q RT-PCR检测人肺成纤维细胞、肺癌细胞株miR-133b表达。miR-133b过表达NCIH1975细胞。将NCI-H1975细胞分为对照组、mimic NC组、miR-133b mimic组、miR-133b mimic+pcDNA3.1组、miR-133b mimic+pcDNA3.1 FGFR1组。CCK-8法检测NCI-H1975细胞增殖抑制率,Transwell实验观察NCI-H1975细胞侵袭、迁移情况。复制裸鼠移植瘤模型并分组,将裸鼠分为对照组、mimic NC组、miR-133b mimic组、miR-133b mimic+AZD4547组,观察各组裸鼠肿瘤体积与重量,HE染色观察各组裸鼠肿瘤组织变化,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况,免疫组织化学法观察裸鼠肿瘤组织Ki-67、Cyclin D1、VEGF-A的表达,Western blotting检测各组肿瘤组织FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2蛋白相对表达量。结果与人肺成纤维细胞HLF-α比较,肺癌细胞株NCI-H1975、A427、NGE-1、A549中miR-133b mRNA相对表达量降低(P<0.05),其中以NCI-H1975细胞中miR-133b mRNA相对表达量最低。miR-133b mimic组miR-133b mRNA相对表达量较对照组和mimic NC组升高(P<0.05)。miR-133b可通过负调控FGFR1抑制肺癌NCIH1975细胞增殖和迁移。miR-133b mimic组移植瘤重量较对照组降低、体积缩小,miR-133b mimic+AZD4547组移植瘤重量较miR-133b mimic组降低、体积缩小(P<0.05)。miR-133b mimic组空泡样变性程度较对照组、mimic NC组减轻(P<0.05),miR-133b mimic+AZD4547组空泡样变性程度较miR-133b mimic组减轻(P<0.05)。miR-133b mimic组肿瘤组织细胞凋亡率较对照组升高(P<0.05),miR-133b mimic+AZD4547组肿瘤组织细胞凋亡率较miR-133b mimic组升高(P<0.05)。miR-133b mimic组VEGF-A、Cyclin D、Ki-67阳性细胞比例较对照组降低(P<0.05),miR-133b mimic+AZD4547组VEGF-A、Cyclin D、Ki-67阳性细胞比例较miR-133b mimic组降低(P<0.05)。miR-133b mimic组FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2蛋白相对表达量较对照组降低(P<0.05),miR-133b mimic+AZD4547组FGFR1、p-ERK1/2/ERK1/2、SOX2蛋白相对表达量较miR-133b mimic组降低(P<0.05)。结论miR-133b过表达可能通过抑制FGFR1-ERK1/2-SOX2轴,抑制裸鼠肺癌NCI-H1975细胞移植瘤生长。

乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白与X蛋白对肾小管上皮细胞核转录因子的影响

目的:目的研究167例乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白(C-terminally truncated middle size surface proteins,MHBst167)和X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对肾小管上皮细胞核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)活化的影响及其相关机制探讨。方法:肾小管上皮细胞系(HK-2)转染mhbst167或(和)hbx后,蛋白印迹法检测NF-κB核易位及其抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκBα)磷酸化水平的变化,凝胶电泳迁移率和双萤光素酶报告基因分析进一步检测NF-κB活性;通过对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性和细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平检测探讨NF-κB活化的机制。结果:HK-2细胞转染mhbst167或(和)hbx基因后,NF-κB核易位、磷酸化IκBα、κB结合活性及κB基因转录均增加(P<0.05);且PKC激酶活性和磷酸化ERK水平也增加(P<0.05),而Raf蛋白均无表达。结论:在肾小管上皮细胞中,MHBst167/HBx可能通过PKC/ERK通路(非Raf依赖性)活化NF-κB。

金黄色葡萄球菌IsdB表位蛋白与HBc蛋白融合表达

目的:采用大肠杆菌表达HBc-IsdB50-285融合蛋白,探讨其在原核表达系统中的表达效果。方法:设计并克隆HBc-IsdB50-285融合基因片段,构建表达质粒pET-28-HBc-IsdB50-285,并转化入E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。SDS-PAGE分析蛋白可溶性及相对分子质量;BCA法测蛋白浓度;采用免疫接种法检测重组蛋白的免疫活性。40只小鼠随机分为rIsdB+adjuvant组、HBc-IsdB50-285+adjuvant组、HBcIsdB50-285组和PBS组,每组10只,间接ELISA法检测小鼠特异性IgG效价值,采用金黄色葡萄球菌Newman株对免疫后小鼠攻毒,检测各组小鼠重组蛋白免疫保护效果。结果:表达质粒pET-28-HBc-IsdB50-285经测序及酶切鉴定证明构建正确;SDS-PAGE分析,重组蛋白以部分可溶形式存在于培养上清中,相对分子质量约为44 000,亲和纯化后蛋白质水平为1.0g·L-1。ELISA检测,使用rIsdB蛋白包被酶标板,HBc-IsdB50-285+adjuvan组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值低于rIsdB+adjuvant组(P<0.01);使用HBc-IsdB50-285蛋白包被酶标板,HBc-IsdB50-285+adjuvant组的小鼠血清特异性抗体滴度的效价值高于rIsdB+adjuvant和HBc-IsdB50-285组。攻毒实验,HBc-IsdB50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球菌免疫保护率低于rIsdB+adjuvant组,但差异无统计学意义(P>0.05);且其与HBc-IsdB50-285未添加佐剂组比较差异也无统计学意义(P>0.05);与PBS组比较,HBc-IsdB50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球免疫保护率升高(P<0.01),HBc-IsdB50-285组小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒保护率亦升高(P<0.05)。结论:HBc-IsdB50-285原核表达载体构建成功;在大肠杆菌中成功表达具有较好生物活性的HBc-IsdB50-285融合蛋白。

以金黄色葡萄球菌重组IsdB137-361为抗原的牛血清抗体间接ELISA检测方法建立

奶牛乳房炎是危害奶牛健康和影响奶业发展的重要而常见奶牛疾病,金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引起奶牛乳房炎的重要病原菌,已经用S.aureus铁调节的表面决定簇B(IsdB)的免疫优势片段IsdB_(137-361)与其他抗原成分构建了预防S.aureus感染的奶牛乳房炎候选疫苗(命名为GIT)。为了检测该候选疫苗免疫奶牛后的IsdB_(137-361)相关抗原的血清抗体,用pGEX-6p-1表达的IsdB_(137-361)作抗原建立了牛血清抗体间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、血清稀释倍数和反应条件进行了优化,确定cut-off值检测了血清交叉反应性和敏感性。结果显示,在抗原使用浓度为2.5μg·mL^(-1)-1、血清1:1000倍稀释、cut-off值为0.45时,该方法具有良好的特异性和敏感性。表明,所建立的间接ELISA检测方法可用于IsdB_(137-361)相关抗原疫苗的免疫牛血清抗体检测。

共刺激分子B7-H1转染角朊细胞对T细胞增殖、细胞因子分泌和表面标记的作用

分析B7 H1共刺激分子阳性细胞激活的T细胞亚群表面标志和细胞因子分泌格局的变化 ,初步鉴定所诱导具有调节功能的人体T细胞亚群生物学特性。用抗CD3、CD2 8抗体分别作为第一和第二信号的来源 ,建立了T细胞体外增殖体系 ,引入B7 H1阳性A4 31细胞。结果表明B7 H1阳性A4 31细胞提供第二信号并加入抗CD3分子时 ,引起纯化的T细胞中等程度增殖 ,IL 10和TGF β升高 ,CD4 5RBlowT细胞亚群比例增加。而在阳性对照组 (同时加抗CD3和抗CD2 8抗体 )可见T细胞高度增殖 ,此时再加入B7 H1阳性A4 31细胞 ,增殖反应受到抑制 ,加入B7 H1封闭型单抗 ,抑制缓解。认为B7 H1阳性A4 31细胞具有双向效应 :当CD2 8不参与共刺激时 ,由B7 H1发挥共刺激作用 ,协同抗CD3抗体引起T细胞增殖 ;一旦T细胞从抗CD3和抗CD2 8抗体获得第一和第二信号出现高度增殖时 ,B7 H1阳性A4 31细胞发挥抑制作用。B7 H1阳性A4 31细胞提供第二信号的T细胞增殖 ,含有呈现典型Tr1细胞表型。针对增殖性T细胞应答 (如移植排斥 ) ,表达B7 H1的非专职性抗原递呈细胞KC ,可选择性诱导人体调节性T细胞 (Tr1)的分化 ,发挥负向调节作用。

早产大鼠肺表面活性物质蛋白质B基因表达的调节

据《中华儿科志杂》1996年11月34卷第6期报道 上海医科大学儿科医院王晓川等,为探讨地塞米松、磷脂酰甘油、转化生长因子-β3（TGF-β3）等对早产大鼠肺表面活性物质蛋白质B（SP-B）基因表达的调节作用,对早产大鼠肺组织块进行了无血清培养,并采用逆转录聚合酶链反应和总RNA抽提、杂交等方法进行了观察。