高山离子芥铁转运蛋白基因编码序列的克隆及其抗逆性表达的实时定量分析

铁转运蛋白(iron transport protein,IRT)是具有跨膜运输离子功能的特殊蛋白质,属于金属离子转运家族的成员.本研究运用RACE方法从高山离子芥(Chorispora bungeana)中克隆得到完整的铁转运蛋白cDNA,命名为CbIRT(基因登录号为EU330924).该基因全长1290 bp,包含1个1035 bp的开放阅读框(ORF),编码344个氨基酸的蛋白.系统进化树分析显示,该基因与拟南芥AtIRT1和遏蓝菜TcIRT-G的亲缘关系最近,同源性分别达到了87.4%和86.5%,而在氨基酸序列水平与拟南芥AtIRT1的同源性达到了89%,表明克隆得到的CbIRT属于金属离子转运体家族成员.实时荧光定量方法对高山离子芥CbIRT基因在不同温度和铁营养水平条件下的表达情况进行分析表明,CbIRT对零下低温和零上低温的表达水平呈截然不同的反应;正常铁营养状态下,CbIRT是微量表达的,而缺铁及低温处理都可以大幅度地促进该基因的表达,富铁可以抑制该基因的表达.显示了该蛋白在转运Fe离子方面的重要作用.

小金海棠二价铁转运蛋白基因MxIRT1定点突变的研究

采用PCR技术对小金海棠(Malus xiaojinensis)二价铁转运蛋白基因MxIRT1的定点突变体系进行了探讨。根据MxIRT1开放阅读框(ORF)两端和突变位点序列各设计一对引物。通过PCR扩增,获得带有突变位点且在突变位点相互重叠的两个PCR片段。对以上两个片段的浓度进行调整后,将其用作PCR反应的模板。对退火温度和延伸时间进行优化后,利用ORF两端引物,将带有突变位点的两个片段拼接起来,从而获得了含有所要突变位点的MxIRT1,并将其插入pEASY-T2载体中。DNA序列分析表明在预期位点上已经发生了突变:MxIRT1编码的第186位密码子已由组氨酸残基变为丙氨酸残基,证明用PCR技术已成功地使MxIRT1基因发生突变。整个突变过程不需要任何回收与纯化步骤,是一个高效、快捷的定点突变体系。

杜梨根系铁吸收关键基因生物信息学分析及缺铁胁迫对其表达的影响

为了探究缺铁胁迫对杜梨根系铁吸收关键基因表达的影响,对杜梨根系铁吸收关键基因三价铁还原酶(Pb FRO2)基因和铁转运蛋白(Pb IRT1)基因的氨基酸序列进行了多重序列比对和进化树分析;采用改良的Hoagland营养液水培杜梨的方法,研究了缺铁胁迫对杜梨根系Pb FRO2和Pb IRT1基因相对表达量以及根系铁和锌含量的影响。结果表明,Pb FRO2蛋白具有还原酶特性,Pb IRT1蛋白属于二价金属离子转运蛋白家族—ZIP家族;缺铁胁迫9 d内,杜梨根系Pb FRO2和Pb IRT1的表达量整体上呈现出先升高后降低的趋势,胁迫3 d表达量达到最高点且与对照(加FeEDTA)差异显著;缺铁胁迫30 d,杜梨根系中铁含量比对照降低77.46%,而锌含量提高1 139.40%。综上可知,缺铁胁迫可诱导杜梨根系铁吸收关键基因表达量升高,进而促进二价金属离子转运蛋白的活性提高。

Fe-EDDHA矫治梨缺铁黄化病应用效果研究

以具有缺铁黄化病的5年生新高梨和1年生杜梨苗为研究对象,探究石灰性土壤条件下施用不同量的无机铁肥(FeSO_(4)·7H_(2)O)和螯合铁肥(Fe-EDDHA)对梨树叶绿体色素、微量元素含量等生理指标和果实品质的影响,及其潜在的作用机理。结果表明:石灰性土壤条件下,施用无机铁肥(FeSO_(4)·7H_(2)O)处理的新高梨叶绿体色素含量、果实品质与清水对照无显著差异;T3处理[株施螯合铁肥(Fe-EDDHA)5 g+2周后株施螯合铁肥(Fe-EDDHA)5 g]的新高梨叶片部分复绿,而T4处理[株施螯合铁肥(Fe-EDDHA)15 g+2周后株施螯合铁肥(Fe-EDDHA)15 g]的新高梨叶片完全复绿,其叶片总叶绿素含量、活性铁含量、单果重和可溶性固形物含量分别较对照显著增加542.0%、251.4%、22.1%和15.3%。缺铁条件下,杜梨二价铁转运蛋白基因PbIRT1表达量升高,二价金属离子转运能力增强,对照和施用无机铁肥(FeSO_(4)·7H_(2)O)处理的新高梨叶片全硼、全铜、全锌、全锰含量与杜梨根系活性铜、活性锌、活性锰含量均高于施用螯合铁肥(Fe-EDDHA)处理。综上,结果初期梨树出现缺铁黄化症状之后,株施螯合铁肥(Fe-EDDHA)15 g+2周后株施螯合铁肥(Fe-EDDHA)15 g能有效提高石灰性土壤上梨树叶片叶绿体色素和活性铁含量,提升果实品质,矫治缺铁黄化病。