Pseudomonas mosselii E1铁载体合成相关基因cysI的克隆与功能初步分析

从棉花根际分离的铁载体产生菌E1,其16SrDNA与Pseudomonas mosselii ATCCBAA-99的同源性为100%。采用三亲本杂交方法将携带转座子Tn5-1063的质粒pRL1063a导入E1中进行转座子插入诱变。利用CAS法,从1000个突变株中,筛选到一株铁载体合成缺失突变株E1-185。利用TAIL-PCR方法,扩增位于Tn5-1063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到E1的cysI基因内。该基因与Pseudomonas entomophila L48的cysI同源性为96%,其CysI氨基酸序列相似性为97%。该基因与半胱氨酸的合成密切相关,而在加有半胱氨酸的CAS平板上,突变株恢复了铁载体产生能力,证明cysI在E1铁载体合成过程中具有重要作用。据推测,cysI可能与铁载体合成途径中关键蛋白acyl-S-PCPs的形成有关。

Pseudomonas pseudoalcaligenes B50铁载体合成相关基因pyrD的克隆与功能分析

从棉花根际分离的一株细菌B50在低铁条件下可以产生铁载体。通过形态学特征、生理生化特征及其16SrDNA序列分析,将其鉴定为Pseudomonas pseudoalcaligenes。采用三亲本杂交的方法将转座子Tn5-1063a(含luxAB)导入B50中,进行转座子插入诱变,获得突变株。用TAIL-PCR方法得到与铁吸收有关的pyrD基因序列。通过互补实验验证pyrD与铁载体的合成有关。Pseudomonas pseudoalcaligenes能够产生铁载体属于首次报道。

酿酒酵母表达和纯化功能性的铁载体合成蛋白PchE

【目的】利用酿酒酵母表达系统,通过乙醇脱氢酶启动子异源表达细菌源的铁载体合成蛋白PchE,并与来源于枯草芽孢杆菌的泛酰化酶Sfp同宿主共表达,探索真核表达体系表达具有生化活性的细菌源蛋白。【方法】从大肠杆菌BAP 1染色体上扩增sfp基因,将pchE基因及串联的pchE与sfp基因分别构建到酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXW55中,各自转化酿酒酵母BJ5464-npgA表达,经过亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,利用HPLC检测细菌源与酵母源表达的PchE在体外重构生化反应中的催化活性。【结果】利用酿酒酵母表达系统可以获得高纯度的原核蛋白PchE。真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰PchE,合成中间产物HPT-Cys。【结论】在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BJ5464-npgA表达系统中,首次证明真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰细菌源的非核糖体肽合酶。比较酵母和细菌宿主的目标蛋白表达,证明酵母表达的巨大蛋白PchE的纯度更高,非特异性条带减少,推测酵母宿主可能更适合表达纯化功能性的巨型蛋白质。

水稻种子相关细菌的系统发育分析与促生能力评价

对15株分离自水稻冀粳14号(90-3)的种子表面及其内生细菌进行了多功能筛选评价和16S rRNA系统发育分析。结果表明,供试菌株都能够溶解无机磷,不能分解有机磷;筛选获得6株具有明显分泌植物生长素吲哚-3-乙酸(IAA)能力的菌株;12株菌株明显产生铁载体,占所测菌株总数的80%,其中7株铁载体产量达到中等水平,通过16S rRNA基因系统发育及聚类分析,供试菌株聚为8个类群,分别属于Rhizobium、Citrobacter、Xanthomonas、Psedomonas、Bacillus、Pantoea、Microbacterium和Moraxella属。