重组血管内皮受体F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白抑制肿瘤生长的实验研究

检测融合表达的F3肽-铜绿假单胞菌外毒素A(F3-PE39KDEL)在抗肿瘤细胞及活体肿瘤抑制方面的作用效果。用MTT法检测F3-PE39KDEL对肿瘤细胞株的抑制活性。小鼠半致死剂量LD50检测毒理学性质,裸鼠成瘤实验检测F3-PE39KDEL对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制。结果表明,融合蛋白F3-PE39KDEL能很好抑制肿瘤细胞和人结肠癌的生长,同时具有较低的生物学毒性。说明F3-PE39KDEL具有抑制人结肠癌生长的潜在应用价值。

重组铜绿假单胞菌外毒素A工程菌的高密度发酵与表达

高密度培养表达大肠杆菌生产重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)。用上海高机公司的30L自控发酵罐,采用分批补料培养技术,维持葡萄糖的浓度始终处于较低的水平,并分批补加氮源,同时溶氧控制在30%～40%,pH自动调控至7.0,培养至对数中期进行诱导。重组菌最终发酵液光密度(A600)未诱导时达到44,诱导时达到36,在上清液中表达的rEPA蛋白的含量占总蛋白的28.1%,在菌体中表达蛋白含量占总蛋白的4.7%。本实验为rE-PA的大规模生产奠定了基础。

铜绿假单胞菌外毒素A的调控基因

铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)外毒素A(PEA)为该菌最主要的致病物质,由toxA基因编码。本文综述PEA的调控基因,包括正调控基因regA、regB、lasR、ptxR、vfr和负调控基因fur、ptxS。regA是影响toxA转录的最主要基因。除lasR外,其余其因均在转录水平上通过regA调控PEA的产量。

铜绿假单胞菌外毒素A表达载体的构建及可溶性表达

目的 实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的可溶性表达。方法 用基因重组技术构建pMAL PEA原核分泌型表达载体 ,并在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果 酶切鉴定及测序结果表明pMAL P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 0 %。表达产物经超声处理后 ,80 %的融合蛋白存在于上清液中 ,说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS PAGE电泳 ,显示为一条蛋白带 ,分子量约为 112kD。结论 成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化 ,获得了稳定表达的工程菌 ,为深入研究PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。

铜绿假单胞菌外毒素A全长基因的扩增与克隆

目的 从绿脓杆菌中提取染色体DNA ,PCR扩增及克隆外毒素A全长基因 ,为实现外毒素A的高效表达奠定基础。方法 从绿脓杆菌培养物中提取染色体DNA ,PCR扩增外毒素A全长基因 ,A -T克隆入本室自行构建的pSK -T载体中 ,对重组质粒进行酶切与测序鉴定。结果与结论 成功地从高GC含量的绿脓杆菌染色体DNA中扩增到长片段的外毒素A全基因并进行了克隆与鉴定。

铜绿假单胞菌外毒素A的生产、分离纯化和鉴定

通过对培养基组成、种子活化、接种量和培养条件进行优化 ,使铜绿假单胞菌外毒素A(PE)产量达到每毫升 5～ 10 μg和 192小鼠LD50 ,不低于国外报道水平。经二步纯化 ,PE蛋白回收率为33.33% (PE)和 16.67% (LD50 ) ,提纯系数为 4 38.5 (PE)或 2 18.5 (LD50 ) ,SDS PAGE呈现一条带 ,相对分子质量为 660 0 0 ,琼脂糖扩散鉴定与兔抗PE产生一条沉淀线 ,小鼠半数致死量为 0 .16μg ,PE对小鼠成纤维母细胞L92 9有毒性作用 ,能被兔抗PE血清所中和。

重组铜绿假单胞菌外毒素A工程菌发酵及表达产物的纯化

目的建立稳定、高效表达重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)的工程菌发酵及表达产物纯化工艺。方法规模化发酵表达rEPA的重组大肠杆菌rPE553D,离心收集菌体,渗透压调解使菌体周质间隙蛋白释放后,高速离心收集蛋白溶液。经DEAESepharoseFF、PhenylSepharose6FF疏水层析和SOURCE30Q强离子交换层析,超滤浓缩纯化rEPA。用HPLC、SDS-PAGE和Westernblot等方法检定生化和免疫学特性,并用小鼠和Vero细胞检定毒性。结果每55L培养基中rEPA产量超过4g,纯度在95%以上,细胞毒性降低了至少32000倍。其余各项指标均符合《中国生物制品规程》要求。结论已建立了收率高、纯度好、稳定、适合规模化生产rEPA的工艺。

分泌型重组铜绿假单胞菌外毒素A基因工程菌的发酵研究

目的 :优化重组铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)基因工程菌的发酵条件 ,实现PEA的高效表达。 方法 :构建PEA的原核分泌型基因工程菌 ,利用摇瓶发酵研究PEA工程菌的最优表达条件 ,并放大至 3.75L发酵罐水平。结果 :摇瓶发酵的最优培养条件为温度 30℃ ,摇床转速 1 6 0r/min ,在含 2g/L葡萄糖的LB培养液中培养至A60 0 ≈ 2 .5时 ,以终浓度为 1 0 0 μmol/L的异丙基硫基半乳糖 (IPTG)诱导表达 5h。 3.75L发酵罐发酵与摇瓶发酵相比 ,发酵周期缩短了约三分之一 ,PEA表达水平接近摇瓶中发酵水平 ,目标蛋白表达率达到了 2 6 .6 %。 结论 :利用摇瓶最优表达条件 。

重组铜绿假单胞菌外毒素A在大肠杆菌中的表达

目的实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的原核载体构建及融合性表达。方法用基因重组技术构建PET-32a-PEA重组体,并在大肠杆菌BL21中进行表达。结果酶切鉴定及测序结果表明PET32a载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达,沸水浴变性后进行SDS-PAGE电泳,在分子量78kD处有一条明显的新生蛋白带。表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的35%。结论成功地对PEA全基因进行了原核载体构建及表达,获得了稳定表达的工程菌,为进一步研出有效的基因工程疫苗和用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。

铜绿假单胞菌外毒素A原核表达载体的构建及鉴定

[目的]对铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。[方法]从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出带信号肽的PEA目的基因,经HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与PET-32a载体进行连接重组。[结果]PET-32a-PEA原核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定,证实其构建成功。[结论]PET-32a-PEA原核表达质粒的成功构建,为进一步研究出有效的基因工程疫苗和用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。

铜绿假单胞菌外毒素A对淋巴细胞转化的抑制作用

目的探讨铜绿假单胞菌外毒素A（PEA）对人淋巴细胞转化的抑制作用及抗．PEA血清的中和作用。方法采集健康成年人的静脉血，密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC）。采用台盼蓝染色排除法及四甲基偶氮唑蓝（MTT）法确定PEA对淋巴细胞的非毒性剂量范围。抑制实验分为对照组、4个不同浓度PEA组及抗血清预处理组6个组。非毒性剂量范围内不同浓度的PEA、植物血凝素（PHA）与淋巴细胞37℃、5％CO2共同温育48h，MTT法测定淋巴细胞转化。结果PEA对淋巴细胞的非毒性剂量范围为0～800ng／ml。PEA浓度在50—400ng／ml，对淋巴细胞转化存在显著抑制作用（P〈0．05）；而抗．PEA血清可完全中和PEA射淋巴细胞转化的抑制作用，与对照组比较差异无显著性（P〉0．05）。结论非毒性剂量的PEA对淋巴细胞转化存在抑制作用，抗-PEA血清具有保护性中和作用。

铜绿假单胞菌外毒素A原核表达载体的构建及表达

目的对铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因进行基因克隆,构建原核表达质粒并进行表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出带信号肽的PEA目的基因,经HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与PET-32a载体进行连接重组。用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等方法鉴定构建成功后,IPTG诱导目的基因表达。结果SDS-PAGE电泳结果显示,在分子量78kD处有一条明显的新生蛋白带。表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的35%。结论PET-32a-PEA原核表达质粒的成功构建及表达,为进一步研究有效的基因工程疫苗和免疫导向治疗的基因重组毒素奠定了基础。

铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆与原核表达

为建立铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(Exotoxin A,ETA)的原核表达方法,采用PCR技术扩eta基因,将其插入pET-28a载体构建重组质粒pET-28a-eta,并对重组质粒进行双酶切、PCR及测序鉴定。转入BL21(DE3)中诱导表达,检测目的蛋白大小及反应原性,然后进行表达条件的优化及其表达形式检测。结果表明,所扩增eta基因大小为1917 bp,与GeneBank参比序列一致性在98.70%;蛋白分析表明,rETA大小为74 KDa,具有和天然毒素相似的反应原性。目的基因在37℃、0.6 mmol/LIPTG诱导3 h获得最佳表达。该蛋白在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但主要以包涵体为主。该研究为进一步开展ETA的批量纯化提供了前提条件。

重组铜绿假单胞菌外毒素A的原核表达和多克隆抗体制备及免疫保护功能分析

为探索铜绿假单胞菌ETA蛋白的免疫保护功能,采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ETA表达菌株;利用切胶纯化获得ETA蛋白并免疫小鼠,制备ETA蛋白多克隆抗体;用ELISA方法,检测出ETA抗血清滴度达1∶8 000;蛋白质印迹分析结果表明,抗血清具有很好的特异性;小鼠免疫保护试验结果表明,ETA对铜绿假单胞菌感染的保护率达50%,显著高于对照组的免疫保护率。用DNAman软件对ETA序列同源性进行分析,发现革兰氏阴性菌的同源性高于革兰氏阳性菌,铜绿假单胞菌种间的同源性高于其他种类细菌的同源性;用MEGA软件对ETA的进化分析结果表明,不同血清型铜绿假单胞菌的亲缘关系高于其他细菌,据此可推测ETA免疫动物产生的特异性抗体可能为不同种类铜绿假单胞菌的感染提供交叉免疫保护。

铜绿假单胞菌外毒素A全基因的克隆与分泌性表达

利用PCR技术从铜绿假单胞菌PA103株DNA中扩增到铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)全基因,选择合适位点插入pBV221 PLPR启动子下游,构建分泌性表达载体;转化宿主E.coliDH5α、JM109后,热诱导表达;SDS-PAGE分析表明表达产物占菌体总蛋白量的17%左右,分子量69kD左右;分离细胞组分蛋白发现仅有少量重组蛋白以成熟毒素形式分泌到宿主菌的周质间隙,并能检测到Vero细胞毒活性,其余大部分以包涵体形式存在。免疫印迹检测显示,表达产物与兔抗EPA多抗有特异性反应。此项工作为重组EPA的研制建立了有用的技术方法。

铜绿假单胞菌外毒素A蛋白疫苗的研制现状

铜绿假单胞菌是一种院内感染的常见致病菌,借助疫苗技术对该菌进行免疫防治是目前的研究热点。铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)具有较好的免疫原性,可作为有效的疫苗候选抗原。对PEA蛋白分子、融合蛋白(PEA-Fla、ntPE-M2e、PEIF、PEA-GP5-M、CVN-PE38、PEA-V3MV26、PEA-HphA和IL-18-PE38)、耦合蛋白(PEA-LPS、PEACSP、PEA-Pfs25、CD4-PEA、G17-PE38和PLGA-PEA)以及核酸疫苗等的研制现状进行了综述。

铜绿假单胞菌外毒素A对小鼠脾淋巴细胞的作用

①目的 了解铜绿假单胞菌外毒素A(PE)对小鼠脾淋巴细胞的作用。②方法 用培养法和MTT法测定PE作用后小鼠脾淋巴细胞的转化率和增殖率。③结果 PE可使小鼠脾淋巴细胞转化率增高 ,但不能刺激淋巴细胞的增殖。④结论 PE在一定的浓度下具有增强细胞免疫功能的作用。

铜绿假单胞菌外毒素A基因DNA片段的克隆及序列测定

目的 建立含有铜绿假单胞菌外毒素A基因DNA片段的克隆株。方法 根据已报道的序列设计铜绿假单胞菌外毒素A基因的特异引物 ,用PCR方法从标本扩增出预期大小的DNA片段 ,并将该片段纯化后与T载体连接 ,转化到大肠埃希菌 ,筛选出含有插入片段的克隆。结果 阳性克隆株经DNA序列测定 ,证实与已报道的铜绿假单胞菌外毒素A基因DNA序列 ,在399个碱基中仅有 3个碱基不同 ,但编码的氨基酸完全一致。结论 成功构建含有铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆 。

铜绿假单胞菌外毒素A基因表达的研究进展

外毒素A(PEA)是铜绿假单胞菌最主要的一种毒力因子 ,它具有ADP 核糖基化转移酶活性 ,通过对延伸因子 2 (eEF 2 )的ADP 核糖基化抑制细胞的的蛋白质合成而导致细胞死亡。PEA由 6 13个氨基酸组成 ,分子量 6 6kD ;其编码结构基因toxA位于细菌染色体上 ,为单一顺反子。本文着重综述近年来对PEA的基因表达及表达调控的研究进展 ,为利用基因工程手段获得高纯度PEA的工作理清一条思路。