重组铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL的克隆、表达与活性检测

目的对铜绿假单胞菌外毒素A的编码序列进行改造,以获得相对分子质量小、活性强的重组毒素PE38KDEL。方法基于铜绿假单胞菌外毒素A的编码序列的高GC含量,通过PCR反应和酶切技术,构建重组毒素PE38KDEL基因,并于大肠杆菌表达,用Westernblot分析表达产物。为检测其生物活性,将其与靶向分子IL4突变体cpIL4(13D)融合,构建融合蛋白表达载体,并于大肠杆菌表达,表达产物经亲和色谱和阴离子交换色谱纯化后,用MTT法检测其对表达IL4受体的黑色素瘤细胞LiBr的细胞毒性。结果成功构建了PE38KDEL基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达,表达量占细胞全蛋白的21%左右;构建了融合蛋白cpIL4(13D)PE38KDEL,并于大肠杆菌AD494(DE3)中得到高效表达,纯化后融合蛋白的纯度达95%以上,细胞毒实验证明其对黑色素瘤细胞LiBr具有良好的杀伤作用,这说明改造后的PE38KDEL是具有细胞毒效应的。结论重组毒素PE38KDEL的构建,为各种导向药物的构建奠定了基础。

铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性。结果经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别。结论PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础。

绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的:通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素(PE)PE38KDEL重组蛋白,并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法:选择PE部分基因(PE38),并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL,通过原核密码子优化(http://www.jcat.de)后全基因合成,经Hind III和Xho I酶切位点克隆至p ET32a(+)原核表达载体,构建p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒,将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细菌中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组PE38KDEL蛋白,经Ni-NTA亲和层析法制备纯化蛋白,采用SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL特异性多克隆抗体,并采集免疫前后血清,用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。结果:成功构建了p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。SDSPAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 k Da,与预计理论值大小相符合。Western blot法检测结果显示,在分子质量约57 k Da处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体,抗体效价高达1:60 000。结论:PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体,且该抗体效价高、特异性强,为进一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。

靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定

目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体p ET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后将其转化到BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并经Western blot验证。通过流式细胞技术检测该免疫毒素与EGFR阳性细胞A549、HT29、MCF-7和EGFR阴性细胞CEM、Jurkat的结合能力后,将其按照一定的浓度梯度进行细胞毒实验研究,72 h后,使用WST-1试剂检测BI7D12-PE38KDEL对上述细胞的杀伤效果。结果:通过SDS-PAGE和Western blot实验验证,成功的制备了重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该毒素大部分以可溶性的方式表达。BI7D12-PE38KDEL能够与EGFR阳性的A549、HT29、MCF-7肿瘤细胞特异性的结合,并且对上述细胞的细胞毒作用与阴性对照组CEM和Jurkat相比具有极其显著性差异(P<0.01)。结论:成功地构建了基于EGFR纳米抗体的重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该免疫毒素能特异性的结合并杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞。

融合PE38的抗CD70纳米抗体免疫毒素的制备及其对肾透明细胞癌786-O细胞的杀伤作用

目的:构建靶向CD70分子的重组免疫毒素,通过表达、纯化制备PE38与抗CD70纳米抗体重组蛋白,体外抗肿瘤实验探究重组蛋白是否对高表达CD70分子的阳性肿瘤细胞具有杀伤活性。方法:通过基因工程手段,将CD70纳米抗体Nb 2B3基因片段通过一个连接子与pET21a-PE38基因片段相连,获得重组表达载体pET21a-Nb 2B3-PE38并转入BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、纯化与鉴定。用间接ELISA及FACS法检测Nb 2B3-PE38与CD70分子的结合活性,MTT法检测Nb 2B3-PE38对高表达CD70分子的肾透明细胞癌786-O细胞的体外杀伤活性,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测Nb 2B3-PE38对786-O细胞凋亡的影响。结果:成功构建抗CD70纳米抗体重组免疫毒素Nb 2B3-PE38,纯化获得纯度>90%的重组蛋白,SDS-PAGE及WB检测结果表明目的蛋白正确表达,分子量为56000。纯化后的Nb 2B3-PE38能与重组CD70抗原及786-O细胞表面的CD70分子特异性结合;25μg/mL Nb 2B3-PE38即对786-O细胞产生极显著的杀伤作用(P<0.001),并且促进786-O细胞的细胞凋亡(P<0.01),其杀伤效应强于阳性对照顺铂(P<0.01)。结论:成功制备了特异性靶向CD70分子的免疫毒素Nb 2B3-PE38,其能够有效杀伤786-O细胞并诱导细胞凋亡且效果强于顺铂。