烟草根际细菌铜绿假单胞菌swu31-2的定殖能力及其对烟草青枯病的防治作用

从重庆黔江烟草田间分离获得一株烟草青枯菌拮抗菌株Pseudomonas aeruginosaswu31-2(简称swu31-2)。采用逐步提高药物浓度的方法,筛选获得了抗链霉素300μg/mL对烟草青枯病菌拮抗活性稳定的swu31-2突变菌株。采用灌根接种法,研究其在烟草根、茎和叶表面及内部的定殖能力及其对烟草青枯病的防治作用。结果表明,swu31-2能在烟草各组织的表面及内部定殖。该菌株在烟草各组织内部的数量均表现为"由增到减"的趋势。在接种后第8天定殖数量达到最高峰,随后有所下降;到第20天各组织内的数量仍然维持较高水平(105cfu/g以上)。同时,在接种20 d后,烟草的根、茎和叶的表面仍然可以检测到swu31-2的存在。盆栽试验结果表明,swu31-2的菌液和活性物质对烟草青枯病均有一定的防治效果。其中先施swu31-2菌液和活性物质粗提物的防效好于农用链霉素(51.25%),分别为60.87%和60.32%,而后施菌液和活性物质粗提物的防效也分别达39.50%和20.90%。

对饮用水中疑似铜绿假单胞菌的复核鉴定

铜绿假单胞菌是一种不允许在饮用水中检出的条件致病菌,本文对10株分离自饮用水样品的菌株进行了菌落形态观察及生化反应确证,并使用HK-MID细菌鉴定系统、VITEK 2全自动微生物鉴定系统和16S rRNA基因测序等多种手段进行进一步鉴定。鉴定结果表明,部分菌株并非铜绿假单胞菌,但均为条件致病菌,从食品安全的角度考虑,不应出现在饮用水、矿泉水中。本文除了探讨以往的研究普遍关注的检验方法的准确性与时效性,还对这些菌株进行了分析,为相关管理部门进行质量监督、制定标准提供了研究依据和借鉴。

铜绿假单胞菌对肺血管内皮细胞功能的影响及其机制

目的探究铜绿假单胞菌(PA)感染对肺血管内皮细胞功能的影响,并探讨其加重小鼠肺部炎症反应的可能机制。方法PAO1菌株感染人肺微血管内皮细胞HULEC-5a 2 h后,采用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测自噬相关基因5(ATG5)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)和钙黏蛋白5(CDH5)的mRNA表达,免疫荧光检测ATG5、PFKFB3和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的蛋白表达。采用小干扰RNA(siRNA)分别敲减ATG5、PFKFB3后,RT-qPCR检测ATG5、PFKFB3和CDH5的mRNA表达,免疫荧光检测PFKFB3和VE-cadherin的蛋白表达,并采用乳酸测定试剂盒检测细胞内乳酸的水平。采用PAO1菌株感染小鼠后,肺组织切片病理染色观察小鼠肺部炎症,激光共聚焦显微镜观察并分析荧光标记的内皮细胞PFKFB3和VE-cadherin的表达量。结果与对照组比较,PAO1感染HULEC-5a细胞后,PFKFB3 mRNA和蛋白表达均增加(P均<0.05),CDH5 mRNA表达减少(P=0.023),VE-cadherin蛋白表达减少(P<0.001),且连续性被破坏,乳酸含量升高(P=0.017)。与PAO1感染HULEC-5a细胞比较,PAO1感染敲减PFKFB3的HULEC-5a细胞后,CDH5 mRNA表达增加(P=0.043),VE-cadherin荧光连续性得到恢复,乳酸含量降低(P=0.047);PAO1感染敲减ATG5的HULEC-5a细胞后,PFKFB3 mRNA(P=0.013)和蛋白表达(P=0.003)均增加,CDH5 mRNA(P=0.020)和VE-cadherin蛋白表达(P=0.001)均减少,乳酸含量升高(P=0.015)。PAO1感染小鼠后,病理HE染色结果显示,肺泡内明显的红细胞渗漏,炎症细胞浸润,肺泡间隔增宽和部分血管内皮细胞脱落。免疫荧光染色结果显示,与正常小鼠比较,PAO1感染小鼠内皮细胞PFKFB3表达增加,VE-cadherin荧光减弱,且不连续。结论PA可能通过AGT5调控PFKFB3通路,破坏肺血管内皮细胞功能,进而加重小鼠肺部炎症反应。

浅谈化妆品中铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检验能力验证方法与结果

为了提高化妆品中铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检验能力,增强实验室间竞争能力,本实验室连续两年参加中检院NIFDC-PT中铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检验能力验证。按照作业指导书及《化妆品安全技术规范》(2015年版)的要求进行前期增菌及生化实验,采用Microfiex LT/SH Smart微生物质谱鉴定仪及VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定仪对分离出的可疑菌进行鉴定。结果显示,两次能力验证结果均检出目标菌,与中检院指定值一致,结果满意。本文对实验过程及结果进行分析讨论,探讨提高检验结果准确性的方法。

抗耐药铜绿假单胞菌DK2增敏剂的结构优化与活性评价

目的发现有效增敏多粘菌素B抗耐药铜绿假单胞菌DK2,并且具有良好安全性和水溶性的化合物。方法将本课题组前期所发现的先导化合物B4进行苯甲酰胺类化合物的设计与合成,并且通过微量肉汤稀释法测试目标化合物对铜绿假单胞菌DK2的体外增敏活性,CCK8测试优选目标化合物HEK-293细胞毒性及HPLC法测试优选目标化合物的水溶性。结果合成了19个目标化合物并进行了结构确证及DK2菌株体外增敏活性测定,其中,目标化合物15a和24a在浓度为32μg·mL^(-1)时将多粘菌素B增敏到浓度为1μg·mL^(-1),并且安全性明显优于B4。此外,24a水溶性优于15a,但未优于B4。结论通过结构改造,得到优选目标化合物24a,为后续开发增敏多粘菌素B抗耐药铜绿假单胞菌DK2的候选药物提供了良好的结构基础。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌膜孔蛋白OprD2基因突变与耐药分析

目的分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌膜孔蛋白OprD2基因突变与耐药情况。方法收集2019年1月至2021年12月南京市高淳人民医院临床标本中的亚胺培南耐药与敏感的铜绿假单胞菌株共90株,均进行细菌鉴定、药敏试验和实时荧光定量PCR检测,对膜孔蛋白OprD2表达量降低的耐亚胺培南铜绿假单胞菌株进行基因序列检测。分析细菌鉴定、药敏试验结果和标本来源情况,比较耐药组与敏感组OprD2的mRNA表达量,分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌的抗菌药敏感性结果、OprD2基因突变类型。结果90株亚胺培南耐药与敏感铜绿假单胞菌中,仪器法最低抑菌浓度≥8μg/ml、纸片抑菌圈≤15mm共45株,纳为耐药组;仪器法最低抑菌浓度≤2μg/ml、纸片抑菌圈≥19mm共45株,纳入敏感组。90株亚胺培南耐药与敏感铜绿假单胞菌主要分布于呼吸内科(40.00%)、神经内科(33.33%),标本类型主要为痰(41.11%)。耐药组铜绿假单胞菌OprD2基因的mRNA表达量为0.32(0.03,1.23),低于敏感组的0.70(0.06,2.68),差异有统计学意义(P<0.05)。耐亚胺培南铜绿假单胞菌株均对亚胺培南、哌拉西林完全耐药,对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南耐药率较低,对阿米卡星、庆大霉素完全敏感,而无耐药性。45株耐亚胺培南株菌中,检出OprD2基因突变或缺失40株,占比88.89%;其中终止密码提前7株、非中断突变及PCR扩增阴性均5株、移码突变13株。结论OprD2基因突变或缺失,会导致膜孔蛋白OprD2表达量明显下降,促使铜绿假单胞菌对亚胺培南产生耐药。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌及其产金属酶的相关基因bla_(VIM-2)研究

目的了解临床分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌(Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,IPMRPa)及其耐药特征,探讨该菌产金属酶和相关基因blaVIM-2对抗菌药物耐药性的影响。方法收集3年临床分离铜绿假单胞菌,采用MIC法测定抗生素耐药性;用复合纸片法筛查IPMRPa产金属β-内酰胺酶的菌株;聚合酶链反应(PCR)法对金属酶相关基因(blaVIM-2)检测并测序确定。结果 1426株铜绿假单胞菌中IPMRPa为910株(63.8%),均为多重耐药;非IPMRPa的516株(36.2%)中仅有71株多重耐药,两者的多重耐药率比较有显著性差异(P<0.05)。在IPMRPa与非IPMRPa的耐药性比较中发现:除四环素外的其他测试抗生素耐药率均有显著差异(P<0.05)。910株IPMRPa中经复合纸片法检出产金属β-内酰胺酶168株,占18.6%(168/910);168株采用PCR扩增出135株(80.4%,135/168)携带有blaVIM-2型基因,扩增产物经序列分析均为VIM-2型。结论 IPMRPa多重耐药现象严重,VIM-2型金属酶基因型在产金属β-内酰胺酶的IPMRPa菌株中检出率高,但该基因并不是产金属酶的铜绿假单胞菌对本研究中12种测试抗菌药物耐药的主要原因。

重庆某三甲医院2014-2016年铜绿假单胞菌耐药表型及金属酶、外膜孔蛋白耐药基因型分析

目的检测亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶基因分布和外膜孔蛋白OprD2基因缺失情况,了解铜绿假单胞菌的耐药状况。方法收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所2014-2016年临床分离的非重复铜绿假单胞菌1 887株,VITEK-MS质谱仪进行菌株鉴定,最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)法测定其对10种常用抗菌药物的敏感性,利用WHONET5.6软件对药敏资料进行统计分析,同时采用亚胺培南-EDTA纸片法筛选金属酶表型阳性的菌株,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)测铜绿假单胞菌金属β-内酰酶(metallo-β-lactamase,MBL)相关基因(IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、NDM)和外膜孔蛋白OprD2基因的情况。结果 3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为756株(9.4%)、579株(9.5%)和552株(10.7%),主要来自ICU病房和呼吸内科病房,标本类型以痰液为主;2014-2016年分离出的铜绿假单胞菌对妥布霉素、庆大霉素的耐药率逐年下降,其耐药率分别从2014年的11.3%、13.2%下降至2016年的7.8%、9.0%,对左旋氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率呈上升趋势,其耐药率从2014年的10.7%、9.2%上升至2016年的23.5%、11.6%。从基因型分布情况来看,269株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中MBL基因阳性51株(18.9%),外膜孔蛋白OprD2缺失158株(58.7%);51株产酶菌株中VIM型阳性29株,SPM型阳性22株,未检测出其他基因型。结论铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率较高;产MBL和外膜孔蛋白OprD2基因缺失是引起铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其耐药表型与外膜蛋白OprD2的关系

目的 了解铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）临床分离株对几种常用抗铜绿假单胞菌药物的敏感性；探索铜绿假单胞菌临床分离株对亚胺培南和美罗培南耐药性差异与其膜孔蛋白0prD2变化的关系。方法琼脂对倍稀释法测定142株Pa对亚胺培南、美罗培南等8种常用抗假单胞菌药物的最低抑菌浓度，从中筛出32株对亚胺培南和美罗培南不同耐药表型的Pa，提取外膜蛋白并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法分离，检测OprD2相对含量。结果耐药率最高的是亚胺培南（54．23％），其次是环丙沙星（45．07％）、美罗培南（28，87％）、氨曲南（19．72％）、阿米卡星（17.61％）、哌拉西林／三唑巴坦（14．08％）和头孢他啶（11．97％），头孢哌酮／舒巴坦耐药率最低（9．86％）。呈现多重耐药的菌株占38．73％（55／142），交叉耐药率高达40．84％（58／142）。在对亚胺培南耐药的菌株中，合并有其他肛内酰胺类抗生素耐药的菌株达到62．34％（48／77）。32株Pa外膜蛋白电泳结果显示OprD2相对含量在耐药组为0～3．5％（其中有一株为8.70％），敏感组为6．20％～10.20％。在碳青霉烯类耐药组与敏感组之间统计分析P〈0．05，耐碳青霉烯类组低于敏感组，但是在亚胺培南耐药、美罗培南敏感组与亚胺培南、美罗培南均耐药组之间差异无统计学意义。结论铜绿假单胞菌耐药菌株常见，且常呈多重耐药和交叉耐药。亚胺培南耐药率高于美罗培南。膜孔蛋白OprD2减少或缺失是我院Pa对亚胺培南耐药的主要原因之一。但在美罗培南耐药中所起的作用，有待进一步研究。

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制——耐药株外膜蛋白OprD_2缺失

目的;研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。方法:以亚胺培南为代表,应用十二烷酸磺酸钠－聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)外膜蛋白图谱、凝胶分光光度扫描分析方法,分别研究临床分离的铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株和亚胺培南敏感株。结果:耐药组OprD2相对含量显著低于敏感组。结论:OprD2的缺失是铜绿假单胞菌对以亚胺培南为代表碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。

哈尔滨地区铜绿假单胞菌外膜蛋白D2与亚胺培南耐药关系研究

目的研究哈尔滨地区铜绿假单胞菌外膜蛋白D2(OprD2)含量改变与亚胺培南(IMP)耐药之间关系。方法采用超声破碎方法提取42株对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌OprD2,进行SDS-PAGE电泳,利用水杨酸盐抑制试验确定OprD2的位置,通过凝胶分析软件分析OprD2的相对含量,并与敏感株进行对比分析。结果42株对IMP耐药的铜绿假单胞菌中,OprD2完全缺失的有11株,减少的有17株,与敏感株相比,OprD2的相对含量明显降低。结论哈尔滨地区铜绿假单胞菌OprD2含量的减少或缺失是其对IMP耐药的主要原因之一。

VITEK2 Compact全自动微生物分析仪对黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌药敏检测评价

目的 评价VITEK2 Compact全自动微生物分析仪对黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌药敏检测结果的准确性。方法 对某院分离的29株黏液型铜绿假单胞菌和30株非黏液型铜绿假单胞菌同时以VITEK2 Compact分析仪法及琼脂稀释法进行药物敏感性试验,以琼脂稀释法为参考方法进行统计学分析。结果黏液型铜绿假单胞菌VITEK2 Compact分析仪法药敏结果的标准符合率（CA）为84.69%,严重错误率（VME）为3.20%,重大错误率（ME）为2.13%,一般错误率（MIE）为9.96%; 非黏液型铜绿假单胞菌VITEK2 Compact分析仪法药敏结果的标准符合率（CA）为94.33%,严重错误率（VME）为0.67%,重大错误率（ME）为1.67%,一般错误率（MIE）为3.33%。两种铜绿假单胞菌VITEK2 Compact分析仪法药敏结果的VME,MIE,CA相比较,差异有统计学意义（χ^2=5.02,10.44,14.55,P〈0.05）。黏液型铜绿假单胞菌VITEK2 Compact分析仪法药敏结果的CA比非黏液型铜绿假单胞菌低,且〈90%,而VME,MIE均比非黏液型铜绿假单胞菌高。结论 VITEK2Compact全自动微生物分析仪对非黏液型铜绿假单胞菌药敏检测结果准确可靠,对黏液型铜绿假单胞菌药敏检测结果准确性较低,黏液型铜绿假单胞菌建议用其它方法做药物敏感性试验。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌OprD_2基因缺失的研究

目的研究耐亚胺培南铜绿假单胞菌(PA)膜孔蛋白OprD2基因缺失情况。方法用琼脂稀释法测定PA对亚胺培南、美罗培南等10种常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC);用聚合酶链反应(PCR)检测80株耐亚胺培南PA的OprD2基因。结果80株耐亚胺培南铜绿假单胞菌OprD2基因扩增44株阳性,经统计学分析,OprD2基因阳性组和阴性组对头孢他啶和氨曲南的耐药率有显著性差异(P<0.05)。结论OprD2基因缺失是PA对亚胺培南耐药的主要机制之一,且与头孢他啶和氨曲南的耐药性有一定关系。

铜绿假单胞菌pcr2基因功能的研究

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,TTSS)是铜绿假单胞菌的重要致病因子,pcr2基因位于TTSS基因簇中popN操纵子的第三位,有关该基因的具体功能研究还是空白。首先,本研究采用定点诱变方法构建pcr2-突变体,发现TTSS表达和分泌ExoS和ExoT蛋白的能力显著下降,在HeLa细胞感染实验中,ExoS和ExoT蛋白注入细胞的数量明显低于野生型菌株。其次,我们采用细菌双杂交系统研究了Pcr2蛋白与其它蛋白结合的可能性,发现Pcr2蛋白与PscB蛋白一起能够结合PopN蛋白,同时Western blot实验发现Pcr2蛋白能够调控PopN蛋白的分泌。最后,实验发现Pcr2蛋白本身也能够分泌到细胞外,可能与TTSS分泌器的早期形成过程有关。

铜绿假单胞菌外膜蛋白D2与亚胺培南耐药关系的研究

目的研究广西地区铜绿假单胞菌外膜蛋白D2(OprD2)的表达与亚胺培南耐药之间的关系。方法采用SDS-PAGE电泳法对提取出的106株耐亚胺培南铜绿假单胞菌的外膜蛋白进行电泳,并利用水杨酸盐抑制实验确定OprD2的位置,通过凝胶成像系统成像并将其与敏感株比较进行分析。结果 106株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中有99株细菌缺失OprD2。结论 OprD2缺失是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因之一。

医院感染耐亚胺培南铜绿假单胞菌与oprD2基因相关的ERIC分型研究

目的探究耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)的oprD2基因缺失在天津地区3所三甲医院内的分布以及该菌的克隆流行情况。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法检测60株IRPA的oprD2基因缺失情况,并以基于肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)方法对其中的54株进行分子生物学分型。结果60株IRPA中有38株oprD2基因缺失,且3所医院的oprD2基因缺失率差异无统计学意义(P>0.05),54株IRPA用ERIC-PCR方法分为30型。结论IRPA的oprD2基因缺失在天津地区的分布差异无统计学意义,且提示尚有其他原因造成亚胺培南/西司他丁耐药株流行;个别科室内的IRPA存在克隆流行趋势,应注意监控IRPA在医院内的暴发流行。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶和oprD2基因的检测

目的:了解我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)oprD2基因和金属β-内酰胺酶(MBL)的分子流行病学情况。方法:铜绿假单胞菌的鉴定和药敏采用VITEK-2系统进行药物的最低抑菌浓度(MIC)检测。应用双纸片增效法和聚合酶链反应(PCR)方法检测其产MBL的表型及相关的oprD2基因、IMP型和VIM型金属酶基因。结果:157株亚胺培南铜绿假单胞菌对多种抗菌药物的耐药率均在40%以上,经双纸片增效法筛选出20株MBL阳性(12.7%),经PCR方法检测20株MBL阳性株中有13株IMP型基因阳性,oprD2基因有67株阳性,其余90株缺失(57.3%),未发现VIM型基因。有10株IRPA既携带IMP型基因同时又有oprD2基因缺失。结论:我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌呈较严重的多重耐药。IMP型基因是我院IRPA产MBL的主要基因型;oprD2基因缺失可能是铜绿假单胞菌亚胺培南耐药的重要原因之一。

铜绿假单胞菌耐亚胺培南相关基因OprD_2研究

目的研究铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。方法取临床分离的铜绿假单胞菌18株,经K-B法检测耐药性,根据耐药性分为耐亚胺培南菌组12株和敏感菌组6株。另设1标准菌株ATCC27853。采用PCR法检测各菌株的OprD2基因,探讨OprD2基因突变与细菌对亚胺培南耐药之间的关系。结果12株耐药菌经OprD2基因扩增,8株阴性,4株阳性;6株敏感菌株及标准菌株扩增全部为阳性。统计学检验结果表明,对亚胺培南耐药菌组和敏感菌组OprD2基因阳性率的差异有极显著性(P<0.01),且在耐药菌中发现了新的OprD2基因突变方式。结论OprD2突变是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制,突变的方式有缺失突变与插入失活。

克拉霉素对铜绿假单胞菌慢性肺部感染小鼠辅助性T淋巴细胞1型/辅助性T淋巴细胞2型免疫平衡的调节作用

目的探讨克拉霉素对铜绿假单胞菌(PA)慢性肺部感染小鼠肺组织辅助型T淋巴细胞(Th)1/Th2免疫平衡的调节作用。方法将54只小鼠随机分入克拉霉素组、0.9%氯化钠溶液组和对照组。克拉霉素组和0.9%氯化钠溶液组通过小鼠气道接种由包裹PA的琼脂糖珠方法建立的PA慢性肺部感染模型,自建模后第7天起分别给予克拉霉素和0.9%氯化钠溶液治疗,对照组小鼠经气道接种无菌琼脂糖珠给予0.9%氯化钠溶液。分别于建模后第7、10、14天处死小鼠。标本进行肺组织细菌培养、病理学检查、支气管肺泡灌洗液(BALF)中γ-干扰素(IFN-γ)/白细胞介素(IL)-4水平测定和肺组织转录因子T-betmRNA/GATA-3mRNA表达水平分析。结果克拉霉素组小鼠在治疗后慢性肺部感染的症状明显改善。经气道接种后第7天,0.9%氯化钠溶液组和克拉霉素组BALF中IFN-γ、IL-4水平均显著高于对照组(P值均<0.05)。气道接种后第14天,克拉霉素组的IFN-γ水平显著低于0.9%氯化钠溶液组(P<0.05)。气道接种后第10、14天,克拉霉素组BALF中IL-4水平均显著高于0.9%氯化钠溶液组和对照组同时间点(P值均<0.05),而IFN-γ/IL-4比值均显著低于0.9%氯化钠溶液组同时间点(P值均<0.05)。气道接种后第7、10天,克拉霉素组与0.9%氯化钠溶液组的Th1、Th2细胞转录因子T-betmRNA、GATA-3mRNA表达水平相近,均显著高于对照组(P值均<0.05)。气道接种后第14天,克拉霉素组T-betmRNA表达水平、T-betmRNA/GATA-3mRNA比值均显著低于0.9%氯化钠溶液组(P值均<0.05)。结论在PA慢性肺部感染初期采用克拉霉素治疗可使小鼠肺组织的Th1/Th2平衡向Th2偏移,有利于缓解气道炎症。

铜绿假单胞菌VIM-2型金属β-内酰胺酶基因的克隆及原核表达重组质粒的构建

目的扩增铜绿假单胞菌VIM-2型金属β-内酰胺酶基因,导入载体pMD18-T和pGEX-4T-1构建重组质粒pMD18-T/VIM-2和pGEX-4T-1/VIM-2。方法采用PCR技术从铜绿假单胞菌扩增VIM-2基因,先将其亚克隆入pMD18-T载体后测定核苷酸序列。再将VIM-2基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,并转化大肠埃希菌JM109。用限制性酶切分析、PCR、序列分析等进行重组质粒鉴定。结果扩增出801 bp的VIM-2基因,构建重组质粒pMD18-T/VIM-2和pGEX-4T-1/VIM-2。结论成功扩增801 bp的VIM-2基因,该基因与国外同类酶的核苷酸同源性100%。重组质粒pGEX-4T-1/VIM-2构建成功。