畜禽粪便源芽孢杆菌多样性及对铜耐受性研究

芽孢杆菌制剂广泛应用于畜禽养殖和粪污处理等领域,铜作为饲料添加剂用于畜禽养殖,导致畜禽粪便中大量残留,在此压力下芽孢杆菌等会产生铜耐受性,由于芽孢杆菌的抗逆性,这种耐受性可由可移动遗传元件介导在环境中传播.本研究采集了多个规模化养殖场的牛粪、鸡粪和猪粪,从粪便中分离芽孢杆菌,通过PCR技术、最小抑菌浓度测定和全基因组测序方法,了解畜禽粪便中芽孢杆菌对铜耐受性.研究发现:(1)分离出芽孢杆菌属23种芽孢杆菌共235株.分离数量前三分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)77株,占总数的32.77%;蜡样芽孢杆菌(B.cereus)31株,占比13.19%;贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)28株,占比11.91%.(2)芽孢杆菌对铜耐受表型和基因型研究发现,铜对芽孢杆菌的MIC集中在200~400 mg·L^(-1),占总数235株的77.87%(n=183),铜耐受能力较高的菌株能够达到500~600 mg·L^(-1),占总数的16.17%(n=38),5株MIC达到600 mg·L^(-1)的菌株全部来自于猪粪.检测了6种铜耐受基因,占比前三的基因分别是pco C、pco D、cop A,比例分别是30.21%(n=71)、29.79%(n=70)、22.98%(n=54),pco A、cop B分别为15.74%(n=37)、15.32%(n=36),检出率最低的为pco R(n=15,P=6.38%).由6种检测到的基因形成了42种携带组合情况,pco系统铜耐受基因组合情况共计39种,携带cop系统铜耐受基因的组合情况仅3种.(3)筛选出不含质粒介导铜耐受基因(pco系统)的高温耐受菌株,进行全基因组测序,分析了菌株携带耐受基因情况及铜耐药基因环境特征.本研究为畜禽粪便堆肥发酵中菌种安全利用提供了依据.