莲铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆和序列分析

用RT—PCR方法，从中国莲（Nelumbo nucifera）幼叶cDNA中成功扩增出铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）全长序列，并进行测序分析．该cDNA序列全长461bp，包括起始密码子和终止密码子．其中编码区段为456bp，共编码152个氨基酸，其编码蛋白的相对分子质量为1．552×10^4，等电点为4．515．与GenBank中其他物种的CuZnSOD进行同源性比较，发现其核苷酸序列相似性高达80％～86％，氨基酸序列相似性达89％～94％．所有已知的CuZnSOD的关键活性位点在该蛋白中均保守存在．将其与一些典型的单子叶和双子叶植物的该蛋白进行进化树分析，为富有争议的莲的系统学地位的确定，在分子生物学上为莲的系统学地位的确定提供了一个依据．该基因已在GenBank登记，序列号为DQ227345．

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、表达、发酵及纯化工艺研究

目的：用基因工程的方法获得人铜锌超氧化物歧化酶（ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ）的高产菌，通过发酵培养，最后纯化获得大量廉价的高纯度的ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ。方法：用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），扩增了人铜锌超氧化物歧化酶（ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ）的ｃＤＮＡ，将此正确测定的ｃＤＮＡ重组到分泌型表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中，重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中用５Ｌ全自动发酵罐表达ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ，表达产物用亲和层析一步法进行纯化。结果：ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ表达产物占菌体总蛋白的３０％，发酵水平酶活力可达９５０ｕ·ｍｌ－１培基，比活为１４００ｕ·ｍｇ－１，经亲和层析后纯度可达８８％，活力回收率大于８０％，比活大于５０００ｕ·ｍｇ－１。结论：我们开展人重组ＳＯＤ的研究不仅大大丰富了应用酶学的内容，而且积极开展应用研究，实现产业化，意义重大。

水稻细胞质铜锌超氧化物歧化酶基因的序列和表达分析

以水稻(Oryza sativa)品种Cpslo17幼穗为材料,通过RT-PCR克隆了长度为698bp的编码水稻细胞质铜锌超氧化物歧化酶基因(OsCu/Zn-SOD)。序列分析表明其覆盖基因完整编码框,编码由152个氨基酸组成的蛋白,它与玉米(Zea maize)Cu/Zn-SOD基因序列的相似率为88%。TargetP和ChloroP预测编码蛋白N端无信号肽序列,且此编码区段有8个外显子和7个内含子。利用Swiss-Model站点预测OsCu/Zn-SOD三维结构,并分析其铜锌离子结合位点的结构。RT-PCR结果表明OsCu/Zn-SOD在水稻不同品种均有表达,但表达量存在差异,OsCu/Zn-SOD在Cpslo17的分裂旺盛的幼嫩组织如幼穗、开花期花序和未成熟种子中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,在愈伤组织中表达微弱。

利用牛血块分离提取铜锌超氧化物歧化酶的工艺研究

改进了传统提取超氧化物歧化酶的工艺 ,即直接用血块 ,加入保护剂、溶膜剂 ,采用机械破碎法破膜 ,热变性及两次乙醇 -氯仿沉淀除杂蛋白 ,然后丙酮沉淀 ,按照此工艺分离提取获得高纯度的Cu ,Zn SOD ,比活达到 6 988U/mg·pro。

仁用杏铜锌元素与多酚氧化酶、超氧化物歧化酶活性的关系

用大田土壤施肥法 ,对仁用杏不同部位铜锌元素与多酚氧化酶 (PPO)、超氧化物歧化酶 (SOD)活性关系进行的研究表明 :同时施用 6 0mg/kg铜液和 6 0mg/kg锌液 ,除使仁用杏细根PPO活性有所降低 (- 7.4 4 % )外 ,其它各部位PPO活性均有提高 (4.5 4 %～ 6 9.6 6 % ) ;铜、锌单独施用 ,也可不同程度地提高 (1.16 %～ 89.2 7% )各部位PPO活性 ;铜、锌对SOD的影响比较复杂 ,二者单独施用 ,可使叶部SOD活性有所提高 (6 .6 7%～ 8.0 1% ) ,同时施用 ,该部位相应值明显降低 (- 2 5 .98% ) ,单独或同时施用对枝部与粗根部SOD活性均有提高 (5 .14 %～ 2 7.71% )作用 ,对干部SOD无明显影响 ,对细根部SOD活性有降低 (- 1.2 5 %～ - 9.5 7% )作用。

陆地棉叶绿体铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与表达(英文)

以陆地棉‘CRI36’的叶片为材料,使用RACE技术克隆到了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD酶基因。基因序列全长共1043bp,含有完整的开放阅读框。推导的氨基酸序列分析显示含有叶绿体信号肽,和已知植物的叶绿体Cu/Zn-SOD酶蛋白的氨基酸残基的同源性在66%～74%之间。基因的表达谱分析显示:棉花叶绿体Cu/Zn-SOD酶基因主要在叶片、茎中表达,根、花和下胚轴中没有检测到信号,即基因的表达主要在棉花的绿色组织。不同生育期的表达谱结果证实:该基因主要在苗期表达,以后表达逐渐减少。用pET-2la(+)构建了原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)的表达结果显示:表达后得到一个29.0kD的新蛋白,其分子量与预期目标一致。对SOD酶活性的分析证实,重组菌的酶活性显著增加,证明克隆的基因具有活性。

Nafion化学修饰圆盘预富集-石墨炉 原子吸收联用法对牛血超氧化物歧化酶中铜、锌分布状态的研究

本文研究了Nafion化学修饰钨丝圆盘预富集-石墨炉原子吸收(GFAAS)方法测定牛血超氧化物歧化酶(SOD)中游离态Cu～(2+)及Zn～(2+)的方法,并用GFAAS法直接测定SOD中铜、锌的总量,证实了牛血SOD中金属辅基铜、锌原子个数比为1:1,初步探讨了一定浓度的牛血SOD中Cu～(2+)、Zn～(2+)的表观离解平衡常数。为提高SOD的活性和稳定性的研究,提供了一种有效的方法。

牛血铜锌超氧化物歧化酶分离提取新工艺

在传统制备超氧化物歧化酶的基础上,进行工艺改进。直接用血块,采用机械破碎法破膜,热变性及两次乙醇-氯仿沉淀除杂蛋白,然后丙酮沉淀,按照此工艺分离提取获得高纯度的Cu,Zn-SOD,比活达到6988U/mg·pro。

野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆分析与原核表达

超氧化物歧化酶是野桑蚕保护酶体系的重要酶类。利用RT-PCR方法克隆出野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)cDNA(EMB I登陆号:AM410997),其开放阅读框ORF长465 bp,编码154个氨基酸。同源性及系统进化分析表明,推导出的氨基酸序列与3种果蝇的同源性平均为69.3%,与线虫为57%,各物种中与Cu/Zn结合的残基高度保守。利用ExPASy的ScanProsite以及PSort和TMpred对此编码的蛋白质结构和功能域分析,预测出其具有2段Cu/Zn-SOD特异序列,且该蛋白不存在信号肽以及跨膜区。将Cu/Zn-SOD cDNA克隆到pET-28 a(+)表达载体,测序鉴定后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定其表达的融合蛋白质分子量为19.4 kD。

虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与转录表达特性分析

利用RACE和克隆等方法得到了虾夷扇贝铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因全长cDNA序列,该序列全长1 064 bp,5'和3'非编码区(UTR)分别为61 bp和541 bp,开放阅读框(ORF)462 bp,编码153个氨基酸和一个终止密码子。分析发现,此氨基酸序列含有形成二硫键的两个半胱氨酸残基以及4个铜结合位点、4个锌结合位点,与已知的Cu/Zn-SOD结构相似,与其它物种同源性较高。进行虾夷扇贝组织分布及发育过程中不同时期的实时荧光定量监测,发现鳃中Cu/Zn-SOD基因mRNA相对表达量最高,肾次之,血淋巴中最低;不同发育阶段Cu/Zn-SOD表达量变化明显,其中受精卵和早期D形幼体两个时期表达量相对较高。

柞蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆与表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内的重要保护性酶类。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的ORF序列。生物信息学分析表明,该序列共编码154个氨基酸,具有Cu/Zn-SOD的保守性结构特征,与家蚕(Bombyxmori)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、野桑蚕(Bombyx mandarina)以及果蝇(Drosophila melanogaster)Cu/Zn-SOD基因的同源性分别是81.5%、81.7%、81.5%、66.7%。柞蚕蛹经紫外线照射处理后用半定量PCR方法检测,发现照射不同时间脂肪体内Cu/Zn-SOD基因的转录水平存在差异,在照射5 min后开始增加,至10 min时为转录高峰,15 min时又呈下降趋势。

水杨酸与烟草铜锌超氧化物歧化酶的相互作用

利用邻苯三酚自氧化法监测了磷酸盐缓冲体系中水杨酸 (SA)对超氧化物歧化酶 (SOD)活力的影响。通过荧光光谱法研究了水杨酸与超氧化物歧化酶的相互作用机制 ,求得两者结合的形成常数和配位数 ,使用F rster非辐射能量转移技术求出了两者的结合位置距色氨酸残基间的距离为 2 .60nm。

病理性瘢痕中脂质过氧化产物和铜锌超氧化物歧化酶的变化

目的了解病理性瘢痕(增生性瘢痕与瘢痕疙瘩)中脂质过氧化产物和铜锌超氧化物歧化酶(copper,zinc-superoxide dismutase,CuZn-SOD)的变化。方法取2005年5月-2005年8月收治患者自愿捐献的标本。瘢痕疙瘩组10例,年龄16～35岁,平均病程2.2年;增生性瘢痕组10例,年龄17～32岁,平均病程8个月;正常皮肤组8例,年龄16～34岁。应用化学比色法测定3组标本中CuZn-SOD活力和丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量,采用免疫组织化学方法观察CuZn-SOD蛋白在病理性瘢痕中的表达,并对其进行评分。结果正常皮肤组、增生性瘢痕组及瘢痕疙瘩组MDA含量分别为(0.8213±0.0864)、(1.1390±0.1067)、(1.1900±0.0748)nmol/mg prot;CuZn-SOD活力分别为(20.60±5.56)、(31.65±2.21)、(34.36±5.01)U/mg prot。增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组MDA含量与CuZn-SOD活力同正常皮肤组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);增生性瘢痕组及瘢痕疙瘩组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学染色观察:3组表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞均有CuZn-SOD蛋白阳性表达。正常皮肤组、增生性瘢痕组及瘢痕疙瘩组在表皮角质形成细胞中免疫组织化学评分分别为(2.20±0.45)、(4.14±0.90)、(4.43±0.79)分;在真皮成纤维细胞中评分分别为(1.60±0.89)、(4.00±0.82)、(4.43±0.53)分。增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组CuZn-SOD蛋白表达与正常皮肤组比较,差异有统计学意义(P<0.05);增生性瘢痕组及瘢痕疙瘩组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论病理性瘢痕中脂质过氧化产物MDA含量增加,CuZn-SOD活力升高、表达增强。

Cu^(2+)和铜锌超氧化物歧化酶作用的光谱学研究

利用邻苯三酚自氧化法监测在磷酸盐缓冲体系中Cu2+对猪肝铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)活力的影响,认为Cu2+与猪肝CuZnSOD存在直接相互作用.通过荧光光谱方法研究了这种相互作用,内源荧光的猝灭实验表明Cu2+与CuZnSOD形成1∶1型稳定配合物;荧光猝灭的动力学分析表明配合物形成过程由两个独立步骤完成:第一步是双分子快速缔合过程,形成了结合疏松的配合物,第二步是单分子慢速过程,即松散的配合物“异构化”成为结合紧密的配合物.FTIR和CD证实相互作用过程伴随了蛋白分子构象的变化.

金属螯合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶

将重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,ZnSOD)包含体(经纯化后纯度达80%以上)以稀释法或透析法初步复性后,分别再经金属螯合亲和层析(MCAC)纯化。结果透析复性样品和稀释复性样品经MCAC纯化后的rhSOD比活是各自上柱前样品比活的2.2倍和5.3倍,蛋白回收率分别为64%和25%,同时两者活性回收率皆大于130%。表明目标蛋白rhSOD在经过MCAC纯化的同时又获得进一步复性。SDSPAGE显示rhSOD为19kD的单一条带,纯度大于95%,比活达到5000umg左右,同时NBT生物活性染色鉴定显示出很强的超氧化物歧化酶活性。表明MCAC对于复性不完全的rhCu,ZnSOD而言是一种纯化和使其进一步复性的简便省时且有效的方法。该方法为以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路。

小麦光温敏雄性不育系BS366铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达分析

超氧化物歧化酶(SOD,superoxide dismutase)是植物中一种主要的抗氧化酶,在植物应对逆境胁迫及抗衰老中起重要作用。本研究从基因芯片数据中筛选获得小麦Cu/Zn-SOD基因的EST序列,通过序列比对后拼接得到小麦Cu/Zn-SOD的候选基因,利用PCR技术在小麦光温敏雄性不育材料BS366中克隆并获得该基因。通过对Cu/Zn-SOD基因序列进行生物信息学分析,结果表明,该基因拥有连续且完整的开放阅读框,长495bp,编码164个氨基酸。氨基酸序列分析发现,该蛋白具有保守的Cu/Zn-SOD功能结构域与典型的Cu/Zn-SOD三维结构,且定位于细胞质中。通过同源进化分析表明,该蛋白与二穗短柄草(Brachypodium distachyon(L.)Beauv.)和大麦(Hordeum vulgare L.)的Cu/Zn-SOD蛋白亲缘关系较近,相似度分别为89%和94%。利用实时荧光定量PCR技术对其在小麦不同组织的表达特异性及不同逆境胁迫下的表达模式进行分析,结果表明,该基因在根、茎、叶、雌蕊、雄蕊、颖壳中均有表达,属于组成型表达,且在小麦的地上部含叶绿体的组织中含量较高;同时受多种胁迫诱导,可能参与了多种胁迫诱导调控途径。通过对该基因在不同育性环境中BS366育性转换期花药中的表达模式分析,发现可育环境下,在小孢子母细胞时期和减数分裂期的表达量分别约为对照的8倍与16倍;而不育环境下,该基因表达水平无明显变化。因而推测,小麦Cu/Zn-SOD基因可能参与了光温敏雄性不育系BS366的育性调控。本研究为深入研究Cu/Zn-SOD基因在小麦中的作用机理奠定了重要基础。

褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶的可溶性表达及其活性分析

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,EC1.15.1.1,简称SOD）是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶类之一,广泛存在于需氧生物、耐氧生物及某些厌氧微生物中。目前已知的SOD主要分为三类,即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。其中,Cu/Zn-SOD主要存在于包括人类在内的所有真核生物的细胞浆内，是目前研究最多的一类；Mn—SOD主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中：

铜锌超氧化物歧化酶(Cu_2Zn_2SOD)在汞电极上的吸附研究

Adsorption behaviors of Cu2Zn2SOD on mercury electrodes were studied by the electrostatic capillary curve and the relationship between polarographic ultimate current and height of mercury column in the absence of the mediators. The effects of impure and denatured SOD on cyclic voltammogram were investigated, confirming that no denaturation was caused during adsorption on mercury electrodes. Double potential step chronocoulometry has confirmed that SOD adsorption on mercury electrode to be the absorption of monomolecular layer.

人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达

以lacF基因为食品级选择标记 ,构建了乳酸乳球菌食品级基因表达系统 ,并进而实现了人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达。首先构建了含有lacF基因两侧同源DNA序列 (0 .5kb)的整合型质粒pUCEmDE ,通过pUCEmDE与乳酸乳球菌MG52 67染色体上单拷贝的乳糖操纵子之间的同源双交换 ,构建了lacF基因缺失突变的食品级受体菌WZ1 0 3 (Lac-) ,并经PCR及Lac表型检测所验证。然后构建了互补质粒pMG36eF ,其lacF基因的表达受组成型的强启动子P32 的控制。将其电转化导入WZ1 0 3后 ,Lac+表型得到恢复 ,表明WZ1 0 3中lacF基因的功能可被互补质粒pMG36eF上的lacF基因互补。随后 ,以互补质粒pMG36eF为基础 ,构建了不含任何抗生素抗性选择标记的人铜锌超氧化物歧化酶基因的食品级表达质粒pWZ1 0 4。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SOD活性凝胶染色分析 ,检测到WZ1 0 3(pWZ1 0 4 )中Cu ZnSOD的表达 ,并且具有生物活性.

家蚕铜锌超氧化物歧化酶的分离纯化及其部分性质的研究

家蚕体液经热变性、DEAE 琼脂糖柱层析、SephacrylS 2 0 0凝胶过滤和等电点聚焦电泳纯化 ,获得达到均一程度的高活性的铜锌超氧化物歧化酶 (Cu .Zn SOD)。活性回收率为 35 % ,纯化倍数为 1911倍。测得该酶的分子量约为 32 0 0 0D ,亚基分子量约为 16 0 0 0D。该酶在紫外光区与可见光区的吸收峰分别为 2 70nm和 6 76nm。测得该酶的等电点为pH 7.15。