何首乌扩增长度多态性反应及银染体系的建立

目的通过对各主要影响因素的研究,建立适于何首乌扩增长度多态性(AFLP)反应体系及银染体系。方法采用改进的CTAB提取方法从何首乌的嫩叶中提取获得总DNA;从酶切DNA的量、时间等考察酶切体系,并设计正交实验进行预扩体系和选扩体系的优化。结果酶切体系DNA的适用量为400ng,37℃酶切5h;用较优的预扩增体系和选择性扩增得到的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,得到清晰的指纹图谱。结论所建立的反应体系可有效地应用于何首乌的分类鉴定和道地性鉴定。

鲤鱼AFLP-银染体系的建立与优化

以鲤科鱼类建鲤为材料,对扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,建立适合于鲤鱼的AFLP反应体系。通过对AFLP常规流程中基因组DNA提取、酶切-连接、预扩、选扩及电泳-银染过程的优化,初步建立了适合鲤鱼的AFLP分析体系:采用鲤血细胞DNA提取;MseI和EcoRI37℃双酶切5h;预扩引物为E+A和M+C;选扩引物E+3与M+3浓度配比为1:8,为提高引物与模板的结合效率,选扩程序均采用touch-down程序;最后结合经典AgNO3-Na2CO3银染显色。通过优化的AFLP程序,从64对引物中筛选出8对多态性引物,为进一步的鲤鱼种质资源研究奠定基础。

红花cDNA-AFLP限制性内切酶的选择及银染体系的建立

目的:建立适于红花cDNA-AFLP分析酶切组合及银染技术体系,为进一步进行红花重要性状相关基因研究奠定基础。方法:对PstI/MseI和MseI/EcoRI两种限制性内切酶组合酶切效率进行比较,并探讨测序板处理中亲和硅烷和剥离硅烷的用量、测序胶中TEMED的用量、预电泳、温度因素、显色液的配置等银染过程中较关键的几个因素。结果:选用PstI/MseI限制性内切酶组合酶切效率较高,测序板应彻底清洁,TEMED量应适中,应进行30 min预电泳,整个铺板电泳过程保持温度恒定,选用4℃冷藏的碳酸钠做显色液效果好,综合以上几方面能显著提高胶图的质量。结论:本研究建立了适于红花的cDNA-AFLP银染体系,PstI/MseI较MseI/EcoRI酶切组合具有更高的多态性率,能更全面地揭示红花研究材料间更为丰富的遗传变异性;银染过程中成功克服了以往试验中常见的撕胶、背景太深、条纹不清晰等问题。

伤寒沙门氏菌扩增片断长度多态性—银染体系的建立

目的建立伤寒沙门氏菌AFLP—银染体系。方法对EcoRⅠ和MseⅠ两种限制性内切酶用量、酶切时间、连接产物及预扩增产物的稀释倍数等进行研究。结果建立了伤寒沙门氏菌AFLP—银染体系在20μl的酶切体系中,含基因组DNA 250ng,EcoRⅠ和MseⅠ各2.5U,37℃下酶切3h;21℃连接过夜;连接产物稀释10倍后进行预扩增;预扩增产物稀释50倍后再进行选择性扩增;选择性扩增完成后加等量Loading buffer,90℃变性3min,立即冰浴;在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析;银染法检测PCR产物。结论AFLP—银染体系有望在伤寒沙门氏菌的多态性研究和流行病学调查中发挥重要作用。

烟草AFLP银染分析体系的建立

以14个烟草品种为试材,初步建立了适合于烟草AFLP分析的银染分析体系:烟草基因组的DNA提取采用CTAB法;地酶切连接同步进行;预扩增选用E+A和M+C引物;选择性扩增选用E+3和M+3引物;扩增产物利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,后用银染法检测。采用优化的体系,20对引物组合扩增出清晰的烟草AFLP图谱。

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。

麻疯树AFLP体系的建立与优化

为了建立麻疯树AFLP(Amplified fragment length polymorphism)反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物,以17份来自不同地方的麻疯树的幼嫩叶片为试材,对影响AFLP分析的关键因素包括DNA的提取质量和浓度、MseⅠ/EcoRⅠ酶切反应时间和浓度、银染方法等进行了研究,从64对引物组合中筛选出适合麻疯树的引物.结果表明,改良的CTAB方法提取的DNA质量比较好.建立了一种适于麻疯树AFLP的优化体系:模板DNA的用量为400ng,酶切反应时间为3h,筛选出了8对适合麻疯树扩增条带多、多态性强的引物.最终建立了适用于麻疯树的AFLP反应体系,并筛选出适合麻疯树的引物,为今后利用AFLP标记技术进行麻疯树的遗传多样性分析提供了标准化程序.