小鼠伊文思蓝尾静脉或腹腔注射及视网膜铺片技术的优化

目的:对小鼠伊文思蓝静脉推注联合视网膜铺片的技术进行优化,以提高视网膜铺片染色实验的准确性和可重复性。方法:C57BL/6雄性小鼠尾静脉注射10g/L(1%)伊文思蓝0.3mL后体内分别循环10、20min,处死后摘取眼球,4%多聚甲醛分别固定20、40、60min,将不同体内循环时间及不同组织固定时间对于视网膜血管的走形、分布及渗漏的影响进行了优化比较。尾静脉注射失败后,通过腹腔注射1%伊文思蓝0.3mL,体内循环3h,固定60min进行补救,观察视网膜血管的走形、分布及渗漏。同时将尾静脉注射后视网膜血管的走形、分布及渗漏与腹腔注射后的结果进行效果比较,确定最佳的体内循环时间以及视网膜铺片的条件。结果:尾静脉注射后,与体内循环20min,固定20或40min条件下视网膜血管情况相比,伊文思蓝体内循环10min,固定60min,视网膜血管走行、血管分支清楚,血管渗漏较少。尾静脉注射失败后,腹腔注射补救措施结果显示视网膜血管走行、各级血管形态清晰。腹腔注射伊文思蓝体内循环3h与尾静脉注射伊文思蓝体内循环10min相比,视网膜血管的走形、分布的效果无明显差别。结论:优化伊文思蓝静脉推注联合视网膜铺片的技术,可提高视网膜铺片染色实验的准确性和可重复性,为相关视网膜血管病变的研究提供借鉴方法。

应用视网膜铺片和神经元逆行标记技术测定神经节细胞密度分布

目的:为视网膜神经节细胞(retina ganglion cell,RGC)的准确定量研究提供形态学的指标依据。方法:联合应用Nissl染色法和神经元逆行标记技术,并通过计算机图像处理技术测定RGC的形态分布特征。结果:两种标记方法在视网膜组织中标记的细胞形态、大小和密度分布呈现明显的差异。Nissl染色可以使所有细胞着色,神经元逆行标记技术仅使RGC着色。通过两者的综合分析,在RGC等密度曲线图中可以观察到在视神经乳头下方形成一个沿鼻颞侧轴方向伸展的高密度区,即视条纹,由视条纹至周边部细胞密度递减。结论:联合应用视网膜铺片法和神经元逆行标记技术两者的优点,能够较准确地测定RGC的密度、大小及其分布等形态特征。

大鼠血管内皮铺片方法的改进

以往的内皮铺片法提供了研究内皮细胞的有力工具 ,但该法存在步骤过于烦琐 ,制备的内皮铺片质量不稳定等缺点。采用灌流固定 ,将内皮剥离后的诸多步骤简化为转膜与烤片 2步 ,不仅大大缩短了时间 ,而且使铺片质量大幅度提高 ,值得推广。

糖尿病大鼠血-视网膜屏障功能评估中伊文思蓝灌注视网膜铺片技术的改良和应用

背景 伊文思蓝（EB）灌注的大鼠视网膜铺片是实验研究过程中观察血-视网膜屏障（BRB）功能的常用方法,但以往视网膜标本经固定液处理后透光性差,仅能用激光扫描共焦显微镜进行观察,对实验设备要求较高. 目的 探讨EB灌注糖尿病（DM）大鼠视网膜后在PBS中制作透明视网膜标本,并用普通荧光显微镜观察BRB功能技术的可行性. 方法 应用随机数字表法将40只SD大鼠随机分为对照组、DM1个月组、DM 3个月组和DM 6个月组.将质量分数2％链脲佐菌素（STZ）溶于0.05 mmol/L枸橼酸缓冲液,以60 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射建立大鼠DM模型,对照组大鼠腹腔内注射等容量枸橼酸缓冲液.分别于造模后1、3、6个月按45 mg/kg的剂量经大鼠股静脉注射30 g/L的EB溶液,注射后15 min摘除双侧眼球,立即置于PBS中完整剥离视网膜,将视网膜放射状切开并平铺于载玻片上,避光晾至完全透明,封片,置于荧光显微镜下观察并拍照.应用IPP6.0软件分析图像,测量EB渗漏区面积与视网膜面积的百分比. 结果 对照组大鼠视网膜血管形态和走行正常,EB在波长546 nm激发光下呈红色荧光,均匀充盈于血管腔.DM 1个月组大鼠视网膜背景荧光较对照组大鼠略增强;DM 3个月组大鼠视网膜背景荧光进一步增强,视网膜血管呈现节段性扩张,可见明显的红色高荧光区;DM 6个月组大鼠视网膜血管粗细不均,部分走行迂曲,可见片状低灌注区及大量高荧光区.对照组、DM 1个月组、DM 3个月组和DM 6个月组EB渗漏区面积百分比分别为（0.05±0.02）％、（0.27±0.06）％、（1.17±0.1 8）％和（4.77±0.66）％,总体比较差异有统计学意义（F=795.800,P＜0.001）,其中DM 3个月组和DM 6个月组大鼠视网膜EB渗漏区面积百分比值明湿高于对照组,差异均有统计学意义（q＆#39;=10.338、43.475,均P＜0.001）. 结论 改良的EB灌注视网膜铺片技术操作简单,普通荧光显微镜下即可清晰显示DM大鼠的BRB结构和动态变化.

小鼠血管灌注造影视网膜铺片操作技术及技巧探讨

目的探讨一种简单且易于规范操作的小鼠血管灌注造影视网膜铺片技术。方法30只生后12～17d龄C57BL/6J小鼠麻醉后行20g.L-1伊文蓝上腔静脉灌注,5min后处死,摘取双眼眼球,40g.L-1多聚甲醛固定,A组20只眼球固定10min,B组20只眼球固定20min,C组20只眼球固定40min,手术显微镜下去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体及巩膜,并将视网膜平铺于载玻片上,荧光显微镜下照相,观察各组差异。结果大体观察:A组视网膜变大、变薄、变形,视网膜面积明显扩大;B组视网膜无变形,保持原有的形态;C组视网膜黏附黑色视网膜色素上皮层,不易分离。荧光显微镜下照相观察:A组铺片成功率为30%,视网膜血管变形,模糊不清;B组铺片成功率为90%,视网膜血管均匀规则分布;C组铺片成功率为30%,黑色视网膜色素上皮层部分黏附,血管背景成像不均匀。结论良好的规范操作技巧和恰当的多聚甲醛固定时间是保证小鼠血管灌注造影视网膜铺片成功的关键。

视网膜血管铺片技术的改进及在糖尿病视网膜病研究中的运用

目的:改进视网膜血管铺片的制备方法,并用于糖尿病视网膜病的研究。方法:分别用胰蛋白酶消化法及胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片,比较铺片成功率。一次性腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,成模13wk时以胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片,行HE染色观察血管形态改变,免疫组织化学染色方法观察RAGE、ICAM-1的表达。结果:胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法较胰蛋白酶消化组铺片成功率高(80%vs53.3%,P<0.05),能显示清晰、完整的视网膜血管网。糖尿病大鼠视网膜无细胞毛细血管较正常大鼠增加2.67倍,毛细血管RAGE及ICAM-1免疫活性分别上调1.26倍,1.43倍(P<0.001)。结论:胃蛋白酶—胰蛋白酶联合消化法是一种稳定的重复性好的视网膜血管铺片技术,可用于糖尿病视网膜病变的研究。

实验性糖尿病大鼠视网膜毛细血管变化规律Ⅰ.血管铺片形态学观察

本研究以链脲佐菌素（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ）制备大鼠糖尿病模型，分别对不同病程大鼠视网膜血管铺片行形态学观察。病程３月时出现病理改变，表现为毛细血管迂曲，血管网不规则，管径粗细不均。周细胞及内皮细胞鬼影，无细胞毛细血管。Ｅ／Ｐ比值升高等。病程６个月时病变进一步加重。

大鼠乳鼠耳蜗基底膜的铺片研究

目的 探讨大鼠生后不同发育阶段耳蜗基底膜的铺片取材方法 ,为耳蜗发育的研究提供完善的技术手段。方法 将生后第 7天和生后第 16天的大鼠耳蜗取出后进行剥离铺片 ,并制成扫描电镜标本。在扫描电镜下观察。结果 基底膜暴露充分 ,Corti’s器表面结构清楚完整。

结缔组织铺片脂肪组织油红染色在组织学实验教学中的应用

目的在传统结缔组织铺片基础上开展脂肪组织油红染色方法在医学本科生组织学实验教学中的应用。方法学生先进行疏松结缔组织铺片,并施行脂肪组织油红o-甲苯胺兰-伊红三重染色,然后镜下观察。结果油红o染色把结缔组织中的脂肪细胞内脂滴保存下来并染上红色。脂肪组织中央的细胞脂滴均匀红染,充满胞浆,周边的脂肪细胞胞浆中油红染色很少,细胞呈空泡状,显示出脂肪细胞亚群存在。甲苯胺兰染色使得疏松结缔组织中肥大细胞染成紫红色,胞核染色浅,细胞数量多、成群分布。伊红可使得结缔组织内除脂肪细胞、肥大细胞意外的其他细胞的胞浆和胶原纤维染成淡红色。结论传统的组织学平铺片技术基础上引入脂肪油红o-甲苯胺兰-伊红三重染色,可增强学生动手能力,并能很好地了解输送结缔组织中细胞的不同表型和分布,丰富组织学内容,把教学、科研连接一起,达到提高实验教学质量的目的。

视网膜血管铺片技术的改进

目的探讨视网膜血管铺片技术的改进及在实验动物小鼠,大鼠,狗和猴中的应用。方法应用蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片,行HE及PAS染色观察血管形态,免疫组化方法观察CD31及VEGF的表达。结果用改进方法制备的视网膜血管铺片,血管网完整,无神经组织残留,可清晰显示血管走向。各级血管形态清晰,血管分支清楚完整,无断裂现象。血管内皮细胞形态清晰。CD31在血管周细胞及内皮细胞均有表达;VEGF主要在内皮细胞表达。结论改进的视网膜血管铺片技术可成功应用于不同实验动物,为视网膜血管性疾病的研究提供了重要途径。

疏松结缔组织铺片方法在组织学与胚胎学实验教学中应用与体会

为了提高《组织学与胚胎学》的教学质量,培养学生的综合素质,在中医院校开展了"疏松结缔组织铺片法"的实验课教学。通过复合染色方法,可一张铺片呈现蓝、红、紫三种颜色,使得镜下能够观察到两种纤维和三种细胞。这种方法的实施不仅增强学生动手能力,而且能很好地了解疏松结缔组织中细胞的不同表型和分布,同时,既丰富组织学内容,把教学、科研连接一起,又达到提高实验教学质量的目的。

改良视网膜铺片联合免疫荧光染色技术在氧诱导视网膜病变模型中的应用

背景氧诱导视网膜病变（OIR）动物模型的视网膜铺片是缺血性视网膜病变研究的有用工具。OIR大鼠或小鼠的幼鼠视网膜面积小且厚，采用传统方法先剪开视网膜再进行铺片实际操作难度较大，影响了对实验结果的定量分析。目的探讨一种易操作、稳定性好的鼠视网膜铺片联合免疫荧光染色技术。方法采用随机数字表法将40只出生后〈6h的SD大鼠随机分为OIR模型组和正常对照组，OIR模型组幼鼠与母鼠一起以24h的时间间隔交替在体积分数80％高氧环境或21％常氧环境中喂养14d，正常对照组大鼠在常氧环境中喂养。于喂养至14d时摘除眼球并剥离视网膜，对完整的视网膜先行谷氨酰胺合成酶（GS）-isolectin B4染色，然后展平视网膜铺片并呈放射状切为4瓣，并于荧光显微镜下拍照，应用Adobe Photoshop CS3图像分析软件系统进行图像拼接处理，获得全视网膜血管图像，采用软件测量每张完整视网膜铺片图像中无血管区及整个视网膜的像素值，最后计算无血管区的像素百分比进行无灌注区严重程度分析。结果采用先行视网膜血管免疫荧光染色再放射状切开视网膜的方法可见视网膜结构完整，展开的视网膜铺片平整，视网膜全周均可见锯齿缘结构。视网膜血管呈强的绿色荧光，血管分支清晰可见，而视网膜的背景绿色荧光较弱。正常对照组大鼠视网膜铺片显示其血管基本发育完全，OIR模型组大鼠视网膜铺片可显示中央视盘旁无毛细血管区及周边大片无血管区形成。结论采用先行视网膜血管免疫荧光染色再放射状切开视网膜的方法制备视网膜铺片简便、易行，较传统的视网膜铺片法更容易确保视网膜结构的完整性，有利于OIR模型视网膜血管形态学的观察和分析。

全耳蜗基底膜硬铺片法的改进和组化观察

目的 :探讨一种观察耳蜗听毛细胞病理改变的耳蜗铺片与酶组织化学检查技术。方法 :采用改良全耳蜗基底膜硬铺片术 ,以琥珀酸脱氢酶 (succinicdehydrogenase,SDH)染色法 ,观察正常豚鼠和噪声性听力损伤豚鼠耳蜗听毛细胞SDH的活性变化。结果 :在光镜下可清晰地观察到听毛细胞SDH的活性变化程度。结论 :该方法操作较为简便、快速 。

单层扁平上皮铺片标本制作方法的探索

单层扁平上皮在机体内分布非常广泛,具有重要的生理功能。制作高质量的单层扁平上皮教学标本,可使学生在显微镜下清晰观察并掌握其基本的形态结构,帮助学生进一步巩固理论知识,加深理解机体组织结构与生理功能之间的关系,对于满足实验教学要求、保证教学效果等具有重要意义。本实验从动物种属、照射方式、硝酸银浓度、浸染时间等方面对单层扁平上皮铺片制作方法进行了较为系统的实验研究。材料和方法：.