硫链丝菌素诱导非小细胞肺癌细胞自噬性死亡

自噬在细胞的生命过程中起了非常重要的作用,它能通过清除受损的细胞器和过多的蛋白质以维持细胞内环境稳定基本能量代谢的稳定。然而,自噬的持续激活可导致细胞器以及必需的蛋白质的过度消耗,导致不依赖caspase的自噬性细胞死亡。因此,通过这种自噬途径诱导细胞死亡可能是癌症治疗的一种新方法。在本研究我们发现,硫链丝菌素能够减少非小细胞肺癌PC-9细胞的细胞活力和诱导细胞凋亡。另外,我们发现硫链丝菌素诱导了PC-9细胞自噬。此外,我们也发现硫链丝菌素诱导的细胞凋亡可以被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻止。这些结果表明,硫链丝菌素促进人体非小细胞肺癌细胞的自噬性死亡。在本研究我们的发现也提示硫链丝菌素联合自噬诱导剂可能在临床上对治疗人非小细胞肺癌有效。

链霉菌I08A1776产生的水溶性链丝菌素

目的分离纯化链霉菌108A1776发酵液中的水溶性抗耐药结核活性成分。方法利用离子交换、反相和亲水作用等多种色谱技术进行分离纯化，通过现代波谱学方法鉴定活性成分结构。结果分离得到3个水溶性活性成分，其结构分别确定为链丝菌素EO）、N^β-乙酰链丝菌素E（2）和β-乙酰链丝菌素D（3）。链丝菌素E（1）对结核分枝杆菌H37Rv和临床分离耐药株的MIC值为0．25～1．0μg／mL。结论首次利用亲水作用色谱分离纯化微生物发酵液中的水溶性活性化合物。亲水作用色谱在微生物水溶性次级代谢产物的分离纯化中具有广阔的应用前景。链丝菌素E具有较强的体外抗耐药结核分枝杆菌活性。

以活性结构单元的突变和修饰为思路的硫链丝菌素的生物合成途径改造

硫肽类抗生素是一类富含硫元素并且被高度修饰的聚肽类化合物,具有良好的抗菌活性。硫链丝菌素作为一类典型的双环硫肽,受到了国内外研究者的广泛关注。本文介绍了硫链丝菌素的生物活性与作用机理、生物合成途径研究及最新进展,提出了以活性结构单元的突变和修饰为思路的硫链丝菌素的生物合成途径改造概念,由此特异性地获得活性更好的硫链丝菌素结构类似物。根据硫链丝菌素的生物合成特点,本文归纳出3种主要的结构改造策略,并对现有案例进行了综述,力求为硫肽类抗生素及相关天然产物的生物合成与结构改造研究提供新的视角。

硫链丝菌素可提高变青链霉菌对阿霉素的耐受性

硫链丝菌素(Thiostrepton,TST)是一种从远青链霉菌(S.aurreus)分离得到的多肽类抗生素,分子量1650。绝大多数放线菌对TST均很敏感,链霉菌重组载体如SLP、pIJ101和SCP2系列质粒以及φ31噬菌体均含有TST耐药标志(tsr),因此,TST是链霉菌遗传研究领域中一种重要的抗生素,最近我们在克隆阿霉素生物合成基因的研究中发现,在阿霉素与TST同时存在于培养基时可明显增强多种链霉菌对阿霉素的耐药性。此现象迄今国内外文献尚未见正式报道。

硫链丝菌素可提高变青链霉菌对阿霉素的耐受性

硫链丝菌素(Thiostrepton,Thio)是一种分离自S.azureus的多肽类抗生素,分子量1650。因为绝大多数放线菌对Thio均非常敏感,所以链霉自遗传工程所构建的重组载体多含有Thio耐受基因(tsr)作为筛选标志。我们在利用p^1J922作为重组载体,变青链霉菌作为宿主克隆阿霉素生物合成基因的研究中首先发现,变青链霉菌和转化有质粒的变青链霉菌孢子对阿霉素的耐受性分别为5ug/ml和10ug/ml。在存在Thio的情况下,上述菌株对阿霉素的耐受性提高一倍。产生这一现象的原因尚不清楚。利用阿霉素产生菌DNA在体外与Thio和阿霉素反应后进行琼脂糖电泳发现:Thio自身对DNA电泳模式无任何影响,但它可明显抑制阿霉素在体外对DNA的嵌合效应。

链丝菌素生物合成基因簇的克隆及其异源表达

通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定,结合DNA序列测定,从刺孢吸水链霉菌AA97026中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇,获得1个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆1H5,其部分DNA序列与链丝菌素生物合成基因相似。含1H5的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份,表明1H5含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。

一个硫链丝菌素抗性基因标记、用于DNA导入链霉菌的pSET152衍生载体(英文)

【目的】在链霉菌PCR-targeting系统中,安普霉素是使用最普遍的选择标记。然而在基因敲除阶段利用安普霉素选择标记后,在遗传补偿时就不能使用相同选择标记的许多重要载体,如pSET152。这常给研究带来不便,特别是当研究对象基因如一些调控基因,其生理功能对剂量敏感时更是如此。基于此,拟以pSET152为基础构建一个不以安普霉素为抗性标记的通用整合型载体。【方法】利用融合PCR和λRed重组等方法构建载体。【结果】来自pHZ1358上的硫链丝菌素抗性基因tsr和来自pCR2.1的氨苄抗性基因bla以"tsr在前bla在后"的次序融合。融合后的抗性片段替换pSET152上的安普霉素抗性基因aac(3)-IV,从而获得新载体pGIM6626。利用该载体将删除的榴菌素最小聚酮合酶基因重新导入到Streptomyces vietnamensis突变株中,该突变株恢复了产榴菌素的能力,证实了该载体的有效性。【结论】构建了一个新的pSET152衍生载体pGIM6626。该载体包含氨苄和硫链丝菌素抗性基因,分别在大肠杆菌和链霉菌中作为选择标记。pGIM6626与pSET152用途相似,但前者由于与PCR-targeting系统不存在选择标记的冲突而与该系统更兼容。

FoxM1抑制剂硫链丝菌素对髓母细胞瘤Daoy细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的研究硫链丝菌素通过抑制FoxMl表达对髓母细胞瘤Daoy细胞顺铂（cDDP）化疗敏感性的影响。方法体外常规培养髓母细胞瘤Daoy细胞株，CCK8法检测1、1．25、1．5、1．75、2、3、5μmol／L硫链丝菌素，1、2、3、4、5、10、20、40μmol／LcDDP及1μmol／L硫链丝菌素与1、2、3、4、5、10、20、40μmol／LcDDP联合处理后对细胞的抑制率．金式公式分析两药间的互相作用：根据分析结果采用1μmol／L硫链丝菌素、3μmol／LcDDP单独或联合作用Daoy细胞24h，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化，Westernblotting检测FoxMl及凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）表达的变化。结果硫链丝菌素可浓度依赖性地抑制髓母细胞瘤Daoy细胞的生长。金式公式分析显示硫链丝菌素与低浓度（1、2、3、4、5μmol／L）cDDP存在明显的协同作用；流式细胞分析仪显示硫链丝菌素单药组、cDDP单药组细胞凋亡率高于对照组，而联合用药组细胞凋产率高于硫链丝菌素单药组和cDDP单药组，差异有统计学意义（P〈0．05）。Westemblowing结果显示，与对照组比较，硫链丝菌素单药组和联合用药组FoxMl蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P〈0．05）；与硫链丝菌素单药组、cDDP单药组比较，联合用药组细胞bcl-2蛋白表达明显下降，而bax、caspase3、PARP蛋白表达明显升高。结论硫链丝菌素和cDDP在低浓度下具有明显的协同抗髓母细胞瘤作用，其机制可能与硫链丝菌素抑制FoxMl表达后增强了cDDP诱导凋广的能力有关。

链丝菌素类抗生素的研究进展

链丝菌素是人类最早发现的抗生素之一。由于链丝菌素类化合物具有广谱的抗细菌和抗真菌的活性,目前已作为重要的农用抗生素进行应用。本文对链丝菌素的抗性机理、各个组成部分(链里啶内酰胺、氨甲酰化D-古洛糖胺和寡聚β-赖氨酸链)的生物合成机理及链丝菌素类化合物的化学合成等方面的研究进展进行了综述,并对链丝菌素的进一步研究方向进行了展望。

FoxM1抑制剂硫链丝菌素对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨FoxM1抑制剂硫链丝菌素对髓母细胞瘤Daoy细胞株增殖及凋亡的影响。方法体外常规培养髓母细胞瘤Daoy细胞株，CCK-8法检测0、1、1．5、2、3、5μmol／L硫链丝菌素作用24、48、72h后细胞存活率的变化；实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫印迹法分别检测0、1、1．5、2μmol／L硫链丝菌素作用48h后细胞FxoM1mRNA和蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果CCK-8检测显示不同浓度硫链丝菌素作用后Doay细胞存活率下降，且呈浓度和时间依赖性，差异有统计学意义（P〈0．05）。24、48、72h的IC50分别为（2．1±0．15）、（1．69±0．11）、（1．39±0．1）μmol／L；RT-PCR和免疫印迹实验显示，与0μmol／L硫链丝菌素组比较，1、1．5、2μmol／L硫链丝菌素组细胞FoxM1mRNA及蛋白水平下降，G2／M期细胞细胞比例和凋亡率升高，凋亡蛋白bax表达增加，抗凋亡蛋白bcl-2表达减少，且均呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论FoxM1抑制剂硫链丝菌素可明显抑制Daoy细胞增殖，可能与阻滞细胞周期于G2／M期、改变bcl-2／bax表达诱发凋亡有关。

微生物所揭示链丝菌素中D-古洛糖胺单元的生物合成机制

链丝菌素是一类非典型的氨基糖苷类抗生素,具有良好的抗菌活性。产品名为中生菌素的链丝菌素类农药广泛应用于水稻白叶枯病和白菜腐心病等农业病害的防治。但链丝菌素产物组分复杂,不同组分之间活性差异较大,对中生菌素产品质量的提升有很大的限制。

中生菌素原药有效成分高效液相色谱-串联质谱分析方法的建立

建立了采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)分析中生菌素(zhongshengmycins)原药中各有效成分(链丝菌素A～F)的方法。原药用去离子水超声辅助提取后经离心过滤,反相离子对高效液相色谱分离,二级质谱检测,标准样品定量离子外标法定量。结果表明:在15.63～500μg/mL质量浓度范围内,中生菌素原药各组分的仪器响应值与进样质量浓度之间呈良好的线性关系,相关系数R2>0.990 5;方法具有较好的精密度和准确度,6次重复进样,其相对标准偏差(RSD)在0.33%～1.96%之间;在0.1、0.5和1μg/mg 3个添加水平下,各组分的回收率在98.2%～101.1%之间。样品实测结果表明:供试原药中链丝菌素D的含量最高,为297.65μg/g;其次是链丝菌素B、C和F,含量分别为247.77、285.64和115.92μg/g;链丝菌素A和E的含量较低,分别为15.63和19.60μg/g。该方法能满足中生菌素原药中各有效成分定性及定量分析的要求。

离子载体添加剂——莫能菌素对肉牛采食量的影响

离子载体添加剂是一类从链丝菌素细菌中分离出来的抗生素,它们能够改变瘤胃的发酵和微生物的代谢,从而使动物的生产性能改变.

淡紫灰链霉菌gCLA4对猕猴桃溃疡病预防效果及抑菌活性成分分离鉴定

为明确分离自黄瓜叶片的内生淡紫灰链霉菌gCLA4菌株(gCLA4)对猕猴桃溃疡病预防效果及其抗菌活性物质,通过室内离体枝条接种及田间喷淋树干的方法评价其预防效果;借助“生物活性追踪”方法,采用离子交换树脂吸附、凝胶柱层析、质谱、核磁共振波谱分析手段对gCLA4的抑菌活性物质进行分离鉴定。室内离体枝条和田间树干喷施结果表明,gCLA4菌株发酵液对猕猴桃溃疡病的防效分别为83.43%和71.07%,明显优于市场对照生防菌剂解淀粉芽孢杆菌Ba168 WP和枯草芽孢杆菌WP。室内分析鉴定显示其主要抑菌成分为链丝菌素F。皿内抑菌结果表明,链丝菌素F与商品中生菌素原药对病菌的抑制效果差异不显著,抑菌圈直径分别为20 mm和22 mm,大于gCLA4发酵滤液的抑菌圈直径16 mm。综上可见:gCLA4对猕猴桃溃疡病防控效果显著,其活性成分链丝菌素F,具有溃疡病绿色防控生物药剂开发应用的巨大价值和潜力。

冬青卫矛内生放线菌YDG17菌株发酵液抑菌活性研究

从冬青卫矛植株中筛选得到一株内生链霉菌YDG17,其发酵液对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。室内生物测定结果表明,YDG17菌株发酵液对供试的11种植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用,其中对小麦赤霉病菌Fusarium gram inearum、番茄灰霉病菌Fulvia fulvum和番茄早疫病菌Alternaria solani的抑制作用最强,EC50值分别为259.98、336.13和100.72mg/L;对供试的3种植物病原真菌孢子萌发也均有一定的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用最强,EC50值为87.84mg/L。离体子叶法测定结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为97.62%,治疗效果为79.63%。盆栽试验结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为71.34%,治疗效果为64.23%。捷克八溶剂系统纸色谱测定结果表明,该发酵液的主要活性物质为碱性水溶性抗生素。选用弱酸性离子交换树脂吸附法对YDG17发酵液活性成分进行了初步分离,并对其活性馏分进行ESI-M S/M S分析,表明其活性物质主要为链丝菌素类化合物,该类化合物为首次从植物内生菌中分离得到。

Thiostrepton介导FOXM1下调对非小细胞肺癌细胞生长及其AG1478药物敏感性的影响

目的:探讨硫链丝菌素(thiostrepton,TST)对肺癌细胞A549增殖及其对AG1478药物敏感性的影响。方法:CCK-8法检测TST、AG1478单药及两药联用后A549细胞的增殖抑制率;Western blot检测不同浓度TST对A549细胞中FOXM1的表达影响;利用RNAi技术沉默A549细胞中FOXM1基因,RT-PCR及Westernblot检测转染效率;集落形成实验检测转染前后细胞集落形成能力的改变。结果:TST明显抑制A549细胞增殖并提高其对AG1478的药物敏感性。TST呈剂量依赖性抑制FOXM1、c-myc、CyclinB1及Bcl-2表达;与对照组相比,FOXM1 siRNA转染组的FOXM1 mRNA及蛋白表达均下降,其下游c-myc、Bcl-2的表达下降,Cleaved-PARP的表达明显上调;转染组集落数为(32.0±3.0)个,明显低于空白组及阴性对照组(NC)[集落数分别为(146.0±4.6)个、(128.7±5.7)个],P<0.05。转染组及NC组细胞集落形成抑制率分别为78.08%、11.87%,转染后细胞的集落形成能力明显降低(P<0.05);AG1478单药组的IC50值是TST与AG1478联用组的5.96倍,P<0.05。结论:TST可能通过下调FOXM1的表达抑制A549细胞的增殖、诱导其凋亡,并增加其对AG1478的药物敏感性。

NYS-4菌株发酵液抑菌活性成分的分离及初步结构鉴定

NYS-4菌株是从秦岭地区土壤中分离到的一株放线菌。采用管碟法及抑制菌丝生长速率法测定了NYS-4菌株发酵液对多种病原细菌和真菌的抑菌活性。结果表明:NYS-4菌株发酵液对白菜软腐病菌Erwinia carotovora var.、猕猴桃溃疡病菌Kiwi ulcer disease germs和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3种病原细菌具有较强的抑菌活性;对西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.Niveum、烟草赤星病菌Alternaria alternate、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum等8种病原真菌菌丝生长亦具有较强的抑制作用。采用离子交换树脂吸附、凝胶柱层析、反相高效液相色谱等方法,结合高效液相色谱-质谱联用(HPLC-ESI-MS/MS)技术,对NYS-4菌株发酵液的活性次生代谢物进行了分离和鉴定,从中分离鉴定出14个链丝菌素(streptothticin)类化合物,其中,N-乙酰化链丝菌素A、N-乙酰化链丝菌素B、N-乙酰化链丝菌素B酸和链丝菌素B酸经初步鉴定为新化合物。

毒三素链霉菌SIPI-2012406抑菌活性产物的分离纯化和结构鉴定

利用大孔吸附、阳离子交换和葡聚糖凝胶过滤等色谱方法从毒三素链霉菌SIPI-2012406发酵液中分离纯化得到3个活性化合物,纯度均达99.5%。抗菌活性测定结果显示,其对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均不超过0.05 g/ml。其中两个化合物的紫外光谱、红外光谱、高分辨质谱和核磁共振谱等研究表明,它们为链丝菌素C和链丝菌素B。该结果说明毒三素链霉菌能够产生链丝菌素类化合物。