ISSR-PCR和链亲和素磁珠吸附法开发白菜SSR引物

分别利用ISSR-PCR和链亲和素磁珠吸附法分离白菜基因组微卫星,共得到41对SSR引物。ISSR-PCR法运用巢式PCR,分别设计微卫星两侧引物IP2和IP3,SSR引物得率为12%。磁珠吸附法首先利用生物素标记的SSR探针与文库杂交,链亲和素磁珠吸附富集含SSR的片段。然后用接头引物扩增,克隆。根据测序结果,设计SSR两侧引物PL和PR,引物得率为9.6%。

单链抗体分子与链亲和素融合蛋白的制备<英文>

研究了抗人纤维蛋白单链抗体分子scFV-8E5与链亲和素融合蛋白的制备。链亲和素拼接在scFV-8E5 cDNA的3’端,制备的融合蛋白单体分子量约45kD。表达产物少数为周质间可溶型蛋白,多数为包涵体。无论是可溶型的蛋白产物或从包涵体中回收并复性的蛋白产物均有结合人纤维蛋白和生物素的功能。这个双特异性融合蛋白的成功制备证明了在scFV-8E5的3’端拼接其它效应分子的可行性。

光化学制备用于链亲和素固定的胺基磁性纳米凝胶的研究

本工作提出制备胺基磁性纳米凝胶的一种改进方法。在含有烯丙基胺的Fe3O4水分散液中,运用紫外光辐照引发烯丙基胺原位聚合,一步法制备了聚烯丙基胺磁性纳米凝胶(Polyallylaminemagneticnanogels,PAA-MNGs)。透射电子显微镜(Transmissionelectronmicroscope,TEM)和光子相关光谱(Photocorrelationspectroscope,PCS)表征了PAA-MNG的形貌和粒径分布;热重分析(Thermogravimetricanalysis,TGA)确定了磁性成分的含量,振动样品磁强计(Vibratingsamplemagnetometer,VSM)测试表明其呈现超顺磁性。利用表面的伯胺基,PAA-MNGs可以方便地偶联蛋白等生物大分子。链亲和素(Streptavidin,SA)经1-乙基3-(3-二甲氨基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化后可以共价固定在PAA-MNGs上,得到链亲和素包覆的纳米磁球(Streptavidin-coatedmagneticnanoparticles,SA-MNPs)。使用探针生物素对硝基苯酯(Biotinp-nitrophenylester,BNPE)通过光谱检测证实了SA-MNPs的生物素结合能力。表明PAA-MNGs适合于作为载体偶联蛋白等生物大分子,并可能用于生物技术领域的诸多方面。

人尿中IgG的时间分辨荧光免疫分析法──以铕标记链亲和素作为标记物

利用铕标记链亲和素作为标记物，建立了固相抗体竞争性的人尿中ＩｇＧ的时间分辨荧光免疫分析法，标准曲线范围０．６２５～４０．０ｍｇ／Ｌ．检测范围宽，可以用于检测人尿中的ＩｇＧ含量，不用对样品进行稀释，能满足临床检测需要．

CD80-链亲和素融合蛋白锚定的鼻咽癌CNE2细胞增强T细胞的杀伤活性

目的:制备CD80-链亲和素(streptavidin,SA)融合蛋白,研究CD80-SA锚定的鼻咽癌CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。方法:pET21a-CD80-SA-6His质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导CD80-SA融合蛋白的表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后透析复性。流式细胞仪检测CD80-SA融合蛋白在CNE2细胞表面的锚定效率;LDH释放法检测CD80-SA锚定的CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。结果:成功制备和纯化了CD80-SA融合蛋白。CNE2细胞表面低表达CD80分子[(2.2±0.18)%]。CD80-SA融合蛋白可有效地锚定于生物素化的CEN2细胞表面,锚定效率可达73%。CD80-SA锚定的CNE2细胞可有效激活T细胞的杀伤作用,效靶比在1∶1、1∶20、1∶40时T细胞的杀伤率分别约为(37±3.12)%、(51±2.63)%和(58±2.47)%,均显著高于对照CNE2细胞激活的T细胞(均P<0.01)。结论:CD80-SA融合蛋白可有效锚定于生物素化的CNE2细胞表面,从而增强T细胞对CNE2细胞的杀伤活性。

抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的稳定性及对动物纤维蛋白的识别

目的：探索抗人纤维蛋白单链抗体链亲合素融合蛋白的应用前景。方法：构建抗人纤维蛋白单链抗体ｓｃＦｖ８Ｅ５基因与链亲和素基因的重组表达载体ｐＳＴＥ２８Ｅ５ ，表达的融合蛋白可特异性识别人纤维蛋白，同时有生物素的结合位点。转化ＪＭ１０９ 后用ＩＰＴＧ 诱导表达，ＥＬＩＳＡ 观察融合蛋白的稳定性。结果：抗人纤维蛋白单链抗体链亲合素融合蛋白稳定性好，可耐受至少２ ｗ ，４ ℃保存、数次反复冻融或一定时间的３７ ℃孵育。它能与大鼠和豚鼠的纤维蛋白结合，而与猪纤维蛋白反应不明显。结论：抗人纤维蛋白单链抗体链亲和素融合蛋白适用于大鼠或豚鼠血栓病模型，是临床前研究的有用材料。

转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:转铁蛋白受体特异性富含于血脑屏障和肿瘤细胞的表面,是当前中枢神经系统疾病和肿瘤治疗中定向转运的重要靶标。拟获得在大肠杆菌中能高效可溶表达的转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素(SA)的重组融合蛋白。方法:根据GenBank数据库报道的SA的核苷酸序列分段合成基因,连接后经PCR获得完整的基因片段,插入pGEM-T载体中测序。将序列正确的SA基因与大鼠转铁蛋白受体单链抗体基因ox26-scFv分别插入原核表达载体pTIG-Trx中,构建重组表达克隆pTIG-Trx/scFv-SA,并在大肠杆菌中诱导表达。ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:对pGEM-T/SA克隆的测序结果显示,合成的SA基因与文献报道相符。重组融合蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,约占菌体上清总蛋白量的30%;ELISA结果表明该融合蛋白具备与转铁蛋白受体和生物素的结合的双重活性。结论:有活性的重组融合蛋白的获得为构建一个通用性的以转铁蛋白受体介导的血脑屏障和肿瘤转运靶向载体打下了基础。

利用生物素-链亲和素系统筛选重症急性胰腺炎肝损伤大鼠HMGB1启动子结合蛋白

目的:筛选重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)肝损伤大鼠高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:牛黄胆酸钠胆胰管逆行注射法制备SAP大鼠模型,与对照组同时处死,取肝组织提取细胞核蛋白,PCR扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将核蛋白与HMGB1探针孵育,然后用链亲和素磁珠分离HMGB1启动子-蛋白复合物,分别用0.25 mol/L和1 mol/L NaCl洗脱探针上结合的蛋白,用SDS-PAGE电泳分离样本蛋白,SilverQuest银染试剂染色,比较SAP组和对照组的差异条带并做质谱鉴定.结果:对照组和SAP组共有14条差异条带,质谱鉴定这些差异条带得到H2A、H2B、H3、H4、S100A9转录相关蛋白.结论:该研究筛选到一些SAP肝损伤特异性的HMGB1启动子结合蛋白,对于下一步研究HMGB1在SAP肝损伤过程中的转录调控机制具有重要意义.

利用生物素-链亲和素系统筛选呼吸机所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白

目的:筛选呼吸机所致肺损伤(VILI)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离HMGB1启动子-蛋白反应复合物,分别用0.25mol/L和1mol/LNaCl洗脱探针上结合的蛋白,SDS-PAGE电泳分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较VILI组与正常对照组的差异条带.结果:两组细胞核蛋白中共观察到24条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,机械通气后有6个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有2个蛋白的结合力减弱;在高亲和力作用水平,有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱.结论:筛选到一些VILI特异性HMGB1启动子结合蛋白,对于研究HMGB1的转录调控机制具有重要意义.

RNase A及其链亲和素融合蛋白在pET系统中的表达

在大肠杆菌中用pET28a表达载体表达重组RNase A。变性条件下,利用His-Resin亲和纯 化,得到60mg／L电泳纯的RNase A。纯化的RNase A复性后,利用含大量RNA分子的碱法抽提质 粒为底物,测定重组RNase A活性,与商品化的RNase A活性相当。同时在RNase A活性测定体 系中加入4 mol／L尿素会使RNA分子切割效率提高10倍左右。在此基础上,成功表达RNase A 与链亲和素(streptavidjn)的融合蛋白,经纯化复性后,该融合蛋白同时具有核酸酶、biotin结合活 性,在分子生物学中具有重要的应用价值。

促甲状腺激素生物素-链亲和素TRFIA定量检测法的建立

用Eu3＋标记链亲和素（SA）,分别用两株识别人促甲状腺素（human thyroid stimulating hormone,hTSH）的单克隆抗体包被96微孔板并生物素化,建立了高灵敏的hTSH生物素-链亲和素（BAS）时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）检测法。本法的灵敏度为0.02mIU/L;批内CV为2.7%~3.5%,批间CV为3.2%~3.8%;平均回收率为100.26%;与电化学发光免疫分析技术（ECLIA）比对,相关系数达0.9544,线性方程为Y=1.3133X-32.297;与ECLIA临床测定值也呈明显相关;正常值范围为0.33~3.09mIU/L。本文建立的hTSH-BAS-TRFIA具有灵敏度高,特异性强,稳定性好,测定范围宽,检测时间短和非放射性等优点,具有良好的应用价值。

用链亲和素-胶体金原位杂交方法检测白血病多药耐药基因的表达

用链亲和素-胶体金原位杂交(ISH-SAG)方法检测了50例急性白血病和2例慢性粒细胞白血病急变患者骨髓单个核细胞多药耐药基因(MDR1)的表达。全部52例患者中24例(46.2％)MDR1呈阳性表达。其中初治组阳性35.7％(10/28),复发难治组66.7％(12/18)。

链亲和素标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子融合蛋白的制备(英文)

目的制备链亲和素(SA)标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA,并鉴定其生物学活性。方法构建原核表达质粒PET24a-6His-SA-L-hGM-CSF和PET24a-hGM-CSF-L-SA-6His,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性。复性后蛋白用DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析进一步纯化。MTT法检测融合蛋白对人红白血病细胞(TF-1)的增殖活性。流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰效率。结果 SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA两种融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,目标蛋白占菌体蛋白的20%以上,纯化后纯度达到96%以上。两种融合蛋白均具有双功能活性,即同时具有hGM-CSF的促进人红白血病细胞增殖的活性和SA介导的高效结合至表面生物素化的MB49细胞的功能(锚定修饰率大于99%)。结论研制的SA/hGM-CSF融合蛋白具有双重活性,可为研制hGM-CSF表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。

链亲和素-胶体金原位杂交检测急性白血病的多药耐药基因表达

用链亲和素-胶体金原位杂交(ISH-SAG)检测了52例急性白血病和4例正常骨髓细胞的多药耐药基因(MDR1)表达。全部52例急性白血病中25例(48.1％)MDR1呈阳性表达,其中初治组MDR1阳性12例(43％),复发难治组MDR1阳性11例(78.6％),两组相差显著P<0.05,完全缓解期MDR1阳性2例(20％)。疗效分析发现MDR1表达与临床缓解率密切相关,MDR1阳性组完全缓解率(52.1％)明显低于MDR1阴性组(88.2％),P<0.05。本研究还同时用免疫细胞化学法检测了P-糖蛋白(Pgp)的表达,两者结果的一致率为84.6％(40/52)。初步结果表明:对检测MDR1检测简便、敏感和特异,为多药耐药的临床研究提供了一个新方法。用ISH-SAG检测MDR1,可预测白血病对化疗的敏感性及预后,并为制定化疗方案提供依据。

链亲和素胶体金原位杂交检测急性白血病细胞的Bax基因表达

Bax是bcl-2基因家族中最重要的基因之一,它是细胞程序性死亡的促进剂并和bcl-2—起对调控肿瘤和白血病细胞对化疗和放疗的耐药性起重要作用。为了进一步研究Bax基因在急性白血病(AL)发病和治疗中的作用,我们采用链亲和素胶体金原位杂交(ISH-SAG)方法检测了30例急性白血病病人和4株白血病细胞系的Bax基因表达,现将结果报告如下。

链亲和素-补体3d(SA-C3d)融合蛋白的制备及其功能检测

目的原核表达链亲和素-补体3d(SA-C3d)融合蛋白,体外探索蛋白活性。方法以C3 c DNA为模板扩增出C3d段DNA,使用一步克隆法将C3d段与酶切后的质粒p ET-24a-6His-SA-IL15相连,获得SA-C3d原核表达质粒。将测序正确的质粒转化入表达感受态大肠杆菌Rosetta中,诱导蛋白表达。使用镍柱亲和层析及梯度逐级减低的变性剂脲素透析复性的方法获得目的蛋白。通过锚定生物素化的MB49细胞实验反映SA的功能,通过促进Raji细胞生长的实验检测C3d的功能。结果成功构建SA-C3d原核表达质粒,通过镍柱纯化与透析复性获得高纯度目的蛋白。该蛋白特异性的与生物素化的MB49细胞结合,促进Raji细胞增殖并呈现剂量依赖效应,体现蛋白SA-C3d具有双功能活性。结论成功制备的SA-C3d融合蛋白可在体外与生物素化的MB49细胞结合并促进Raji细胞增殖。

用标记链亲和素生物素过氧化物酶法检测BVD/MD

瑞士学者B.Thür等应用标记链亲和素生物素过氧化物酶法(a labelled streptavidin biotin peroxidase method)对具有腹泻症状的284头牛进行牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD/MD)病毒检测,检出65头为阳性。该免疫组织学方法适用于检测未予固定组织的冰冻切片中的BVDV。

链霉亲和素-人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的制备与活性鉴定

目的:制备链霉亲和素(SA)连接的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白(SA-hGM-CSF),并对其生物学活性进行鉴定。方法:在NCBI数据库中查找SA和hGM-CSF序列,将序列合成后连接入Pet28表达载体中,构建SA-hGM-CSF-Pet28重组表达载体,在BL21(DE3)表达感受态中利用IPTG诱导剂诱导表达,经His镍柱纯化,尿素梯度复性,聚丙烯酰胺凝胶电泳法和蛋白质印迹法(WB)鉴定融合蛋白,通过TF-1细胞检测融合蛋白的生物学活性。结果:SA-hGM-CSF融合蛋白可在BL21(DE3)中高效诱导表达,经His镍柱纯化后该融合蛋白纯度较高。经尿素梯度复性后,细胞学实验验证该融合蛋白具有生物学活性。结论:成功表达具有生物活性的融合蛋白SA-hGM-CSF,该结果为SA-hGM-CSF表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研究提供了实验基础。

链亲和素-磁性微粒的制备及其应用

通过物理吸附和共价作用机制,制备两种链亲和素-磁性微粒,即链亲和素-金磁微粒和链亲和素-氨基磁粒,并对其在不同缓冲液中的稳定性进行研究;采用酶抑制法测定两种链亲和素-磁性微粒对游离生物素的结合能力;分别以紫外吸收和固相核酸杂交方法,测定两种链亲和素-磁性微粒对生物素标记寡核苷酸探针的固定化容量及活性,并与Dynabeads（R）M-270 Streptavidin进行比较.结果表明：通过物理吸附作用制备的链亲和素-金磁微粒,适用于核酸杂交与检测常用的STE（Tris-NaCl-EDTA）缓冲系统,通过共价作用形成的链亲和素-氨基磁粒,适用于STE和磷酸盐（PBS）缓冲系统;1 mg链亲和素-金磁微粒和链亲和素-氨基磁粒对游离生物素的最大结合容量分别为4950和5115 pmol;对生物素标记寡核苷酸探针（24 mer）的结合容量分别为2839和2978 pmol,测定结果均是Dynabeads（R）M-270 Streptavidin的6～7倍;与FITC-标记互补寡核苷酸的杂交结果表明,固定于链亲和素-磁性微粒表面的寡核苷酸探针保持了较好的生物学活性.

链亲和素标记的白细胞介素4双功能融合蛋白锚定治疗小鼠浅表性膀胱癌

目的探讨链亲和素标记的白细胞介素4（IL-4-SA）双功能融合蛋白治疗小鼠浅表性膀胱癌的效果。方法制备IL-4-SA双功能融合蛋白，测定其体外生物学活性。建立小鼠浅表性膀胱癌模型，膀胱经生物素化后给予IL4-SA灌注治疗，观察小鼠生存期，并以链亲和素标记的绿色荧光蛋白（GFP—SA）＋IL-4和磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照组。检测各组小鼠脾细胞的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性和CD8＋肿瘤浸润淋巴细胞。结果IL4．SA能够锚定于生物素化的膀胱表面达5d以上。在MIM9细胞种植后的第80天，PBS组小鼠全部死亡，GFP-SA＋IL-4组小鼠存活2只，而IL4-SA组小鼠存活5只。在肿瘤特异性杀伤实验中，在效靶比为1：1、25：1、50：1时，PBS组小鼠的CTL杀伤率分别为（3．3±0．6）％、（7．3±0．6）％和（12．7±2．1）％，GFP．SA＋IL4组小鼠的CTL杀伤率分别为（4．3±0．6）％、（9．0±1．0）％和（14．3±1．5）％，而IL4-sA组小鼠的CTL杀伤率分别为（11．3±1．2）％、（22．7±1．5）％和（31．0±3．0）％，IL4-SA组与PBS组和GFP—SA＋IL-4组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。CD8＋淋巴细胞检测结果显示，PBS组和GFP．SA＋IL4组的肿瘤组织内仅有少量的CD8＋淋巴细胞浸润，而IL-4-SA组则有较多的CD8＋淋巴细胞浸润。结论IL4-SA锚定膀胱表面能够产生强烈、持久的免疫应答反应，有可能成为浅表性膀胱癌的一种新灌注治疗方法。