轻链替换文库对抗HBs基因工程Fab抗体亲和力的影响

目的测定轻链替换文库对基因工程Fab抗体的亲和力的影响。方法将PCR扩增的人抗体轻链基因插入已克隆有人源抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体重链Fd基因的噬菌粒中，构建成轻链替换文库，经亲和淘洗，从该文库中筛选与重链Fd基因相匹配的轻链基因。结果链替换的噬菌体抗体（phab）的ELISA光吸收值（A）从0．43±0．09提高到最高为1．24±0．10。序列分析ELISA光吸收值（A）最高的5株phab的轻链基因，3株κ链的碱基序列基本一致，属ⅤκⅢ亚群，2株λ链的基因序列相同，属ⅤλⅠ亚群。结论所筛选出来的phab具有抗HBsAg的特异性。

链替换技术提高噬菌体抗体亲和力的研究进展

高亲和力抗体基因的克隆是噬菌体抗体在基础研究、临床诊断治疗研究等重要领域中应用的基础。链替换技术已逐步广泛用于噬菌体抗体的性能改造。该技术不仅可以促进噬菌体的体外亲和力成熟,提高抗体亲和力,有助于低剂量抗体达到实际应用所需要的抗原结合效应,拓宽抗体的应用开发前景,而且可应用于减少抗体人抗鼠抗体反应,分析重链或轻链基因对抗原抗体结合的影响,有助于较好的理解免疫化学。就链替换的原理、策略及其应用进行综述。

DNA及基于DNA链替换反应的分子计算

DNA是生物遗传信息的载体,同时也是一种理想的生物相容材料.单链黏性末端(toehold)协助的链替换反应是DNA常温纳米技术的基础.利用DNA的碱基互补特性和碱基序列的可编程性,人们可以基于DNA链替换反应构建分子机器并对其运转进行精确调控,实现各种复杂分子计算.本文回顾了近年来DNA结构和力学性质方面的研究进展,探讨DNA链替换反应的微观理解,介绍DNA分子计算领域的最新成果,以及它在DNA恒温自组装等方面的应用.

DNA:结构、链替换反应和反应网络

DNA不仅是生物遗传信息的载体,更是一种可精确操控和设计、高度生物相容的高分子材料.由于DNA的特异性碱基互补配对和碱基序列的可编程性,人们设计了DNA链替换反应.基于链替换反应,可以构建链替换反应网络,实现特定的功能.本文综述了近年来在DNA结构和力学性质、链替换反应的微观机制和速率调控机制、反应网络构建和调控,及其在球形核酸自组装和细胞组装等方面的研究进展.最后,我们展望了DNA链替换反应网络未来研究和发展方向.

轻链替换提高抗HBsAg噬菌体抗体的结合力

通过轻链替换，提高抗ＨＢＳＡｄｅ菌体抗体的结合力。方法将ＰＣＲ扩增的人抗体轻链基因，插至已克隆有人源抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体重链Ｆｄ基因的噬菌粒中，构建成轻链替换文库，通过亲和淘洗，筛选与Ｆｄ相匹配的轻链基因。结果经亲和淘洗后，筛选出了与Ｆｄ相匹配的轻链基因，链替换后，噬菌体抗体（ＰｈＡｂ）的ＥＬＩＳＡ光吸收值（Ａ）从０．４３±０．０９提高到最高为１．２４±０．１０。抑制实验证实所筛选出来的ｎｈａｂ具有抗ＨＢｓＡｚ的特异性。分析了ＥＬＩＳＡ光吸收值（Ａ）最高的５株噬菌体抗体的轻链基因序列，结果表明，３株ｋ链的碱基序列一致，属ＶｋⅢ亚群；２株链的基因序列相同，均属ＶＩ亚群。结论结果表明经链替换的噬菌体抗体结合力得到了较大提高，并具有与ＨＢｓＡｇ合的特异性。

铜绿假单胞菌实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增方法建立及应用

目的建立一种快速检测铜绿假单胞菌的实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增(real-time RAA)方法。方法基于铜绿假单胞菌ecfX基因设计特异性引物和exo探针,通过灵敏性、特异性和疑似菌株检测评估所建立方法的有效性。结果Real-time RAA方法在39℃等温条件下反应20 min即可实现对铜绿假单胞菌的有效检测;特异性强,仅对铜绿假单胞菌出现特异性扩增;灵敏性高,对铜绿假单胞菌基因组DNA的检出限为3.0×10^3 fg/反应,对纯培养铜绿假单胞菌的检出限为1.0×10^3 CFU/反应。应用所建立的real-time RAA方法对分离的36株疑似铜绿假单胞菌进行检测,结果均为铜绿假单胞菌,同VITEK 2 Compact生化鉴定方法和real-time PCR方法结果一致。结论本试验所建立的real-time RAA方法反应快速、操作简单、可靠性高,可用于不同来源的铜绿假单胞菌的快速检测和鉴定。

罗非鱼湖病毒逆转录重组酶介导链替换扩增(RT-RAA)快速检测方法的建立

为建立针对罗非鱼湖病毒(TiLV)的逆转录重组酶介导链替换扩增(RT-RAA)快速检测方法,在NCBI建立的核酸序列数据库GenBank中获取TiLV全基因序列,以其假定蛋白基因片段为依据,设计上游引物3个、下游引物3个(交叉构建9组引物组合)和1条探针。构建TiLV的RNA标准品、筛选引物组和优化扩增温度后,分析该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,在TiLV RNA标准品基础上,确定F1/R3引物组和最佳温度为39℃,于20 min的短时间内,该方法即可检测出TiLV。该方法特异性强、灵敏度高,检测下限达到5.2×100copies/μL。30份临床样品中共检出2份阳性样品,检测结果与荧光定量RT-PCR结果相符。结果表明,本研究建立的RT-RAA检测方法可操作性强,重复性好,适用于TiLV的现场快速检测。

Toehold 开关调控的大肠杆菌基因表达体系

设计了一种核糖体调节器—“立足点开关”(toehold switch)。与传统核糖体调节器设计不同的是,该核糖体调节器的起始密码子(AUG)和核糖体结合位点位于核糖体调节器中发夹结构RNA的环(loop)上,而“茎”(stem)结构是完全互补配对的RNA双链。通过RNA链替换反应,引发链(trigger)RNA能够打开发夹结构RNA,从而激活下游绿色荧光蛋白的表达,导致荧光信号的增长,最终实现对大肠杆菌基因表达的调控。系统研究了“茎”的长度对绿色荧光蛋白表达的调控作用。实验结果表明,当“茎”的长度大于8个碱基时,发夹结构RNA就能有效地抑制绿色荧光蛋白的表达。进一步的共表达实验结果表明,引发链RNA能够打开发夹RNA,从而调控大肠杆菌基因表达。Toehold开关调控的大肠杆菌基因表达系统具有可拓展性,可应用于多基因表达调控,对基因疾病诊疗具有潜在应用价值。

恒温荧光扩增法快速检测食品中金黄色葡萄球菌

目的建立恒温荧光扩增法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌.方法基于重组酶介导链替换核酸扩增技术针对金黄色葡萄球菌nuc基因的保守区域设计特异性引物和探针,建立了检测金黄色葡萄球菌的恒温荧光扩增检测方法,并评价其敏感性、特异性、重复性和符合率.结果该方法可在常温(37~42℃)实现核酸快速扩增,20 min即可完成反应;敏感性较高,金黄色葡萄球菌的检出限为9.12×10^(2) CFU/mL;特异性强,与大肠埃希氏菌O157∶H7、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌的核酸均无交叉反应;不同稀释度菌液检测阈值时间的变异系数为5.78%~5.93%,重复性较好;采用该方法与荧光聚合酶链反应方法同时对50份临床样品进行检测,总符合率均为100%,差异不显著(P>0.05).结论本研究建立的金黄色葡萄球菌恒温荧光扩增检测方法具有敏感性高、特异性强、时间短的特点,可用于金黄色葡萄球菌的快速检测.

单克隆抗体人源化研究进展

目前单克隆抗体大多数是鼠源的 ,在临床重复给药的治疗过程中有许多副作用。由于技术限制 ,最好的解决方法就是研制人源化抗体 ,以代替鼠源单抗用于临床。

制备高亲和力的噬菌体抗体

由于构建噬菌体抗体库时细菌的转化效率较低，所以从抗体库中筛选出来的抗体其亲和力都较低。本文就目前在实验条件下，筛选较高亲和力的噬菌体抗体的几种方法进行了综述。

关于自中心图的一点注记

本文定义了一种加链替换运算,并证明了定理即两个自中心图通过这种运算所得之图其自中心性保持不变.

基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用

从天然抗体库中筛选得到的抗体通常亲和力较低,在微摩尔水平;同时,经过多次免疫获得的天然抗体也存在100 pmol/L的亲和力极限。然而,以抗体亲和力体内成熟为理论基础的亲和力体外成熟技术,可以模拟体细胞高频突变和克隆选择过程。该技术可以解决库来源抗体亲和力不高、实际应用难的问题,也可以帮助天然抗体突破其亲和力极限。抗体基因体外突变技术可以模拟自体高频突变过程,是抗体亲和力体外成熟的重要手段,常见的抗体基因体外突变技术可以分为易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、DNA改组、突变株、定点突变和链替换等方法。易错PCR可以在抗体基因全长或部分区域随机引入突变,但随着突变率的增加,阳性克隆数量呈指数性递减。DNA改组包括抗体片段随机化切割和重组步骤,可以加快抗体的体外进化速度。突变株法易于构建超大容量的抗体库,但有害突变和突变率难以控制。定点突变的区域通常选择与抗原直接接触的互补决定区(complementary determination region,CDR)或自体突变热点进行操作。链替换通常保留母体抗体的一条重链或轻链,而对另一条链进行随机化组合。这些基因突变方法在提高抗体亲和力中获得了不同程度的应用,但也存在效率不高,且方法选择较为盲目等问题。可是,采用抗体X射线晶体衍射和计算机模拟等方法,却可以帮助预测抗体结合部位,为突变位点的理性设计和方法选择提供有效信息,因而成为亲和力体外成熟技术未来发展的趋势之一。

鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速的鲤浮肿病毒(CEV)重组酶介导的链替换扩增(RAA)检测方法,本研究通过比较分析CEVP4a基因序列,设计引物与探针,经过筛选优化,建立了实时荧光RAA检测方法。结果显示,该方法在39℃恒温反应20min即可快速、特异性地检测出CEV,与常见的鱼类病毒不发生交叉反应,其对质粒标准品的检测下限为2.8×10^1拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于5%。利用本研究建立的方法对35份临床鲤科鱼类样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。本研究建立的检测方法操作简单,特异性强、敏感性高,结果可靠,不依赖于复杂的仪器,适用于现场对CEV的快速检测。

不同投资期限互斥项目投资评价方法的选择

文章认为不同投资期限 (含建设期 )互斥项目的财务可行性评价 ,没有固定的评价方法 ,应根据不同的情况选择不同的评价方法 ,不能一概而论。同时阐述了平均净现值法和替换链法以及净现值法 ,在不同投资期限互斥项目财务可行性评价中需具备的假设条件 ,以便决策者正确地运用评价方法 ,从而减少决策失误。

售后配件BOM管理系统浅析

介绍了售后配件BOM与工程BOM和制造BOM的关系,并针对配件BOM的需求特点阐述了配件管理的基本要点:零件的层级结构关系、车辆的配置特征与配件使用表示法、零件的替代链等,以及售后运作过程中如何从整车物料特征快速准确获得正确配件的离线和在线解析方法。

猪肺疫、猪丹毒病原RAA检测方法的建立

重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)技术是一种新的检测技术,本研究分别基于猪丹毒CPS基因序列和猪肺疫KMT基因序列,使用分子生物学软件Oligo 7.0分别设计两套特异性引物、探针,建立猪丹毒、猪肺疫的RAA检测方法,并分别对其特异性、灵敏度和稳定进行测试。结果显示,所建立的两种方法将巴氏杆菌、丹毒杆菌显著区分于大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、Ⅱ型猪链球菌等其他猪细菌性传染病病原,单个样品检测时间约20分钟,最低均可检测到100个拷贝数量级的重组质粒DNA。

基于CRISPR/Cas13a的马尔堡病毒核酸检测方法的建立

【目的】建立一种基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 13a,CRISPR/Cas13a),针对马尔堡病毒核酸的快速检测方法。【方法】根据马尔堡病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)基因保守区序列设计合成特异性的逆转录酶重组酶介导链替换核酸扩增(reverse transcription recombinase aided amplification,RT-RAA)引物及CRISPR RNA(crRNA),利用RT-RAA等温扩增技术对靶序列进行扩增,通过CRISPR/Cas13a系统检测扩增产物,并结合消线法(easy-readout and sensitive enhanced,ERASE)侧流层析试纸进行结果判读。最后利用国家标准品对建立的新方法的灵敏度和特异性进行评估。【结果】筛选出一组针对马尔堡病毒NP基因的高效扩增引物和crRNA,建立了用于马尔堡病毒检测的CRISPR-ERASE方法,可在1 h内检测出浓度为1 copy/μL目标核酸,并与其他多种病原体无交叉反应。【结论】本研究基于CRISPR/Cas13a建立了一种快速、简便、高灵敏度和高特异性的马尔堡病毒核酸检测方法。