2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶重组蛋白的制备及鉴定

目的链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphotase,STP)是重要的磷酸化信号调控系统成员之一。文中对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP编码基因stp进行原核表达并对纯化蛋白进行酶活测定。方法对S.suis 2 stp进行生物信息学分析,PCR扩增stp基因片段,构建重组表达载体pET28a::stp。将载体转入E.coli BL21中,经IPTG诱导,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)为底物测定其水解量进而鉴定磷酸酶活性。结果从05ZYH33基因组中PCR扩增到810 bp的片段,经连接获得重组表达载体pET28a::stp;经诱导表达及纯化获得相对分子质量为32000的重组蛋白,该蛋白在Mn2+存在下能够水解pNpp。结论获得纯度较高的STP重组蛋白,该蛋白具有Mn2+依赖的磷酸酶活性,为后续阐明STK/STP磷酸化系统的调控机制打下基础。

肺炎链球菌重组PrtA蛋白克隆与表达的相关研究

目的构建携带PrtA基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组PrtA融合蛋白。方法根据GenBank中肺炎链球菌表面蛋白细胞壁相关丝氨酸蛋白酶A(PrtA)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增目的片段,建立了RT-PCR检测方法。应用RT-RCR方法扩增得到PrtA蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-PrtA,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-PrtA。将含有pET-30a-PrtA的重组菌,经终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导后,重组PrtA蛋白获得高效表达。通过Westernblot检测结果,检测表达的重组PrtA蛋白的反应原性。结果所获PrtA基因与GenBank的基因序列同源性为99%;重组质粒经IPTG诱导,不同浓度的IPTG均能诱导重组蛋白表达,且IPTG终浓度为0.6mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的18%。通过抗-His标签单克隆抗体在IPTG诱导6h的重组菌蛋白中检测到一条大小约为40×103的特异性清晰条带,与预期结果相符,表明表达的蛋白为肺炎链球菌重组PrtA蛋白。结论成功地克隆和表达了肺炎链球菌表面蛋白细胞壁PrtA,为进一步研究以PrtA蛋白作为免疫原预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病奠定基础。