圆斑酶联免疫吸附试验诊断囊虫病——生物素-亲和素酶复合物在该方法中的应用

目的：应用生物素－亲和素－酶复合物系统，建立一种繁感、特异、经济简便的囊虫病血清学诊断。方法：生物素－亲和素－酶复合物圆斑酶联免疫吸附试验（ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）、滤纸血斑ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ。结果：ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ 诊断囊虫病，检出率（９５．９２％ ）远较圆斑酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）高８３．６７％ ，平均几何滴度（１∶２ ８０１．７３）约为Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ（１∶５８７．２６）的５ 倍；用该方法对４℃条件下保存３ 月的患者滤纸血斑样本进行检测，阳性率为９４．７４％ （５４／５７），无假阳性反应（０／４５）；对相同患者血清和滤纸血斑双份血样进行检测，阳性率均为９０％ （２０／２２）。结论：该方法提高了检出率，简化了采样及送样程序，适合于边远地区和用于流行病学调查。

基于己烯雌酚-生物素双功能配体的己烯雌酚化学发光酶联免疫吸附检测技术研究

目的基于己烯雌酚-生物素双功能配体和生物素-亲和素信号放大系统建立生物素-亲和素化学发光酶联免疫吸附试验(biotin-avidin-amplified chemiluminescent immunosorbent assay,BA-CLIA)法检测牛奶中的己烯雌酚的方法。方法采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺法[N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide,EDC/NHS]制备己烯雌酚-生物素双功能配体;棋盘滴定法优化己烯雌酚-生物素双功能配体与抗己烯雌酚单克隆抗体的最佳稀释比例;对有机溶剂、离子强度、pH等影响因素进行优化后建立基于直接竞争化学发光免疫吸附试验检测己烯雌酚的标准曲线;通过特异性试验测定该方法与己烯雌酚结构类似物的交叉反应率;最后选取牛奶进行加标回收试验验证该方法在实际样品中检测的可行性。结果BA-CLIA法对己烯雌酚的半数抑制浓度为3.45 ng/mL,检出限为0.020 ng/mL,与传统竞争酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法比较,检测灵敏度提高了6.22倍;BA-CLIA法与己烯雌酚类似物(双烯雌酚、雌二醇、雌三醇和双酚A)的交叉反应性较低,显示了较好的特异性;采用该方法检测牛奶中的己烯雌酚,平均加标回收率为92.80%~95.74%,变异系数小于等于8.05%。结论该方法灵敏度高、特异性好,适用于牛奶中的己烯雌酚的测定。

生物素—链霉亲和素免疫学测定地高辛的研究

方法为竞争酶联免疫吸附方法，待测物质为血清中地高辛，采用国产链霉素和素直接包被塑料板孔，生物素标记地高辛抗体。其测定灵敏度为0．0964μg/L,最低检测限为0．225μg/L,测定三份低、中、高浓度的血清标本，批内变异系数分别为8．9％、5．9％和2．4％；批间变异系数分别为15．8％，10．1％和9．2％，测定回收率在89．1％－107．22％之间，此法与FPIA方法相关良好（r=0.9488).

应用生物素-链霉亲合素放大ELISA系统检测抗环瓜氨酸肽抗体

目的用生物素-链霉亲合素放大ELISA系统建立一种敏感、特异、经济简便的抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体的测定法。方法用链霉亲合素(SA)预包被,使生物素化的CCP(bio-CCP)固相化,摸索检测抗CCP抗体的最优实验条件,并进行方法学考核和临床应用评价。结果本法对类风湿关节炎(RA)的诊断敏感性为69.4%,特异性为96.8%,阳性预测值为89.1%,阴性预测值为94.1%,阳性似然比为19.28,阴性似然比为0.317,Youden指数为0.658。与欧蒙试剂比对,两法所测抗CCP抗体吸光度/cutoff比值显著相关(n=61,r=0.9253,P<0.001)。在所统计的168例血清样本中,两法同时阳性者60例,同时阴性者105例,一致性百分率达98.2%,结果具有高度一致性(Kappa=0.961,P<0.001)。ROC曲线分析结果显示本法所测抗CCP抗体对RA诊断准确性达到了一个较高水平(AUCROC值=0.901)。在13例诊断为早期RA者中,有10例抗CCP抗体阳性(阳性率76.9%),未发现抗CCP抗体与RA患者临床症状、疾病活动指标(ESR)及RF水平有关。结论成功将生物素-链霉亲合素ELISA系统应用于抗CCP抗体检测,方法敏感、特异、可靠,可用于RA的常规实验室诊断。

生物素—亲和素系统检测食品中黄曲霉毒素B_1的研究

建立了ABC—ELISA检测食品中AFB_1的方法,最小检测值0.01ng/孔,灵敏度比普通ELISA高10倍,检测时间缩短1h。方法灵敏、特异、简便、快速,样品提取液可直接用于测定。对抗体标记生物素的方法、溶剂影响、反应时间等作了较详细的讨论。对3类食品(83份样品)加标回收率为70-100％,变异系数为7.7 17.3％。将本法测得的12个玉米样品中AFB-1值与国家标准检测法测得的值作配对资料的t检验,P>0.05,说明两种方法测得结果间的差异无显著性。

应用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法检测原发性肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶

目的观察生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附（ELISA）法检测原发性肝癌（PHC）特异性欧曼陀罗凝集素强结合的γ-谷氨酰转移酶（DSA-GGT）的临床应用价值。方法对45例正常对照者、58例PHC患者和203例非PHC患者（包括其他肿瘤患者36例，肝良性病变患者167例），应用生物素-链霉亲和素ELISA法检测受试者血清中DSA—GGT的水平，同时用ELISA法检测受试者血清中甲胎蛋白（AFP）的水平。结果58例PHC患者中，DSA—GGT阳性38例，检测DSA-GGT诊断PHC的灵敏度为65．5％；203例非PHC患者中，DSA—GGT阳性18例，检测DSA—GGT诊断PHC的特异度为91．1％。该方法的平均批内及批问变异分别为8．9％和11．5％。58例PHC患者中，AFP阳性40例，检测AFP诊断PHC的灵敏度为69．0％；203例非PHC患者中，AFP阳性19例，检测AFP诊断PHC的特异度为90．6％。DSA-GGT与AFP联合检测诊断PHC的灵敏度和特异度分别为93．1％和85．7％。结论生物素-链霉亲和素ELISA法检测DSA—GGT和ELISA法检测AFP对PHC诊断的灵敏度和特异度相近，且前者的重复性良好，可作为PHC诊断的较好检测方法；DSA—GGT与AFP联合检测可显著提高PHC诊断的灵敏度。

双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测相思子毒素

目的建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法,为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据。方法采用双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法来检测微量abrin。结果该法检测abrin线性范围为0.125～31.25μg/L,线性回归方程为Y=0.52369X+0.51632(r=0.9816,P<0.0001,n=9),检测限为0.125μg/L。不同浓度蓖麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰,表明该法检测abrin具有很好的特异性。该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析,相对标准差为2.35%～4.14%,具有较好的重现性。结论成功建立了夹心BA-ELISA法检测abrin,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的,可适用于各种微量abrin样品的分析。

生物素—亲和素体系测定雌酮

雌酮与牛血清白蛋白共价结合,合成雌酮的完全抗原.利用此抗原免疫小鼠,通过细胞融合技术制备了雌酮的单克隆抗体经纯化表征知,抗本是IgGl型,相对分子量为164000,与固定抗原的亲和常数为8 2×108L/mol. 以生物素化的羊抗鼠免疫球蛋白及辣根过氧化物酶标记的链亲和素为标记体系,通过竞争抑制的方式测定游离的雌酮.结果表明:雌酮在10～10000

妊娠相关血浆蛋白A酶联免疫诊断方法学研究

目的建立供临床检测妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的酶联免疫诊断方法。方法用足月孕妇血清通过分子筛以及离子交换层析纯化后制备抗体,进而制备生物素标记的PAPP-A以及酶标记抗体。按照常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)操作步骤检测标本,观察本方法的敏感性、特异性、回收率、稳定性等指标。测定30份早孕患者血清与美国DRG公司试剂盒做对比。结果分子筛与离子交换层析纯化效果良好。标准曲线范围为1～50μg/mL。敏感性为0.35μg/mL,回收率均>100%,特异性、稳定性试验结果显示效果良好。本试验方法与美国DRG公司试剂盒检测结果高度相关,回归方程为:Y=2.286 1+1.026 9X(r=0.982,P<0.01)。结论PAPP-A抗体标记生物素后,利用生物素与亲和素的高度亲和力进行ELISA,该方法在PAPP-A的临床检测中有较大的实际意义。

ABC法测定CMV IgM中关键试验影响因素的研究

用正交试验统计方法,考察ABC法检测CMV IgM中关键试验因素。依据影响程度对抗原浓度、载体处理、封板液和包被时温等进行排序。结果表明载体预处理和封板液选择在ABC法试验中至关重要。采用正交试验得出的最佳试验方法较常规方法科学、准确和省时。

心肌营养素-1 ELISA测定法的建立及初步应用

目的应用生物素链霉亲和素酶联免疫吸附法(BSA ELISA)建立血浆心肌营养素1(CT1)测定法,并初步应用于冠心病患者血浆CT1水平的检测。方法用鼠抗重组人CT1单抗包被酶标板,加入待测抗原,并依次加入生物素化羊抗重组人CT1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记链霉亲合素,用H2O2邻苯二胺显色。检测35名冠心病患者及对照组血浆CT1含量的变化。结果方法的线性范围为10～2000pg/ml,检测下限为10pg/ml,批内变异系数为1.76%～7.64%,批间变异系数为5.96%～9.04%。结论该方法简便、快速,特异性、敏感性、重复性均在临床检测可接受范围内,标准曲线线性良好,适用于基础研究与临床检验。

基于生物素化纳米抗体的果蔬中百草枯超灵敏免疫检测方法研究

通过纳米抗体活性口袋生物素化修饰实现识别活性提升,并以生物素化纳米抗体(Biotin-Nb2-12)作为识别元件,结合生物素-多聚辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(polyHRP-SA)亲和识别信号系统,建立了检测果蔬中百草枯的生物素-链霉亲和素酶联免疫分析方法(BA-ELISA)。经多参数系统优化,所建方法的检出限(LOD)达0.58 pg/mL,半数抑制浓度(IC_(50))为14.1 pg/mL,线性范围为1.7~116.2 pg/mL,且与功能及结构类似物无显著交叉反应。相比传统间接竞争酶联免疫分析方法(icELISA),该法的IC_(50)提高了85倍,抗体消耗量降低至1/8,在大白菜和雪梨样品中的平均加标回收率为94.5%~116%,可用于果蔬中百草枯的痕量检测。

免疫-PCR法检测柯萨奇病毒B组抗原的实验研究

目的 :建立免疫 - PCR法 ,对分离培养的柯萨奇 B组病毒 (Cox B)毒株及临床可疑为 Cox B感染的血清标本进行检测。方法 :以间日疟原虫 SSU r RNA基因为指示分子 ,采用生物素进行末端标记 ,利用酶联免疫吸附试验 (EL ISA)和 PCR原理 ,建立免疫 - PCR法 ,并对 6 0份临床标本进行检测。 结果 :该方法具有较高敏感性和特异性 ,其敏感性是 EL ISA法的 3 0 0 0倍 ,也高出 RT- PCR法 10倍。 结论 :免疫 - PCR法是检测 Cox B抗原的敏感而特异的方法 ,为 Cox B的临床早期快速鉴定和流行病学研究等提供了一种新的微量抗原检测手段。

乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立

目的建立一种定量检测乙肝表面抗原(HBsAg)的化学发光免疫分析方法并评估其性能。方法利用双抗体夹心法实验原理,用吖啶酯标记多抗,用生物素标记两株单抗,通过磁颗粒链霉亲和素-生物素系统分离固相和液相完成检测。结果本方法的检测限为0.05IU/mL,线性范围为0.05~150IU/mL,可溯源至国际标准品,批内变异小于5%,总变异小于8%,浓度高达106IU/mL的强阳样本未出现HOOK效应;5套阳转盘对雅培Architect、西门子centaur和强生VITROS发光试剂相对敏感系数分别是3、0、-3;国家参考盘检出达标;与雅培Architect比较,2000例临床样本检测灵敏度为99.77%,特异性为100%,一致性达99.95%。结论本研究建立的HBsAg定量检测试剂,各项指标均满足临床检测的要求,灵敏度高,特异性好,适合临床推广应用。

心肌重构对抗β_1受体自身抗体及免疫功能的影响

目的检测心肌重构患者血清中抗β1受体自身抗体和相关免疫指标的变化情况,探讨其变化特点、相互关系及临床意义。方法选择心室壁增厚、心腔与心壁比值增大、拟行手术的患者28例,正常人10例作为对照。应用链霉亲和素酶联免疫吸附测定技术(SAELISA),测定血清中抗β1受体自身抗体;应用流式细胞技术,测定CD3+、CD4+、CD8+含量及CD4+/CD8+比值,IgG、IgA、IgM及C3、C4含量。结果当心肌发生重构时,患者产生抗β1受体自身抗体,随着术后好转,该自身抗体也会随之降低。当抗β1受体自身抗体存在时,机体的细胞免疫CD4+/CD8+比值明显增高,体液免疫5项指标均有先下降后上升的趋势,与细胞免疫基本一致。结论心肌重构后,患者抗β1受体自身抗体的变化能反映术后疗效及心脏功能的恢复情况,可用来指导临床治疗。免疫功能的变化,说明心肌重构早期,机体免疫功能受到抑制,应注意围手术期采用综合性预防感染的措施。

免疫聚合酶链反应检测方法初探

为了提高抗原抗体检测的灵敏度，利用生物素亲和素系统对免疫聚合酶链反应（免疫－ＰＣＲ）检测方法的建立做了初步探索。结果表明，免疫－ＰＣＲ可检测到少至１００ｆｇ的抗原，比酶联免疫吸附试验平行对照高１０００倍。该法仅限于实验模型的建立，其实际应用价值还有侍于深入研究。

游离PSA与总PSA比值在前列腺疾病诊断中的应用

目的 :探讨总前列腺特异性抗原 (T_PSA)、游离前列腺特异性抗原 (F_PSA)及F_PSA/T_PSA(F/T)比值的变化在良性与恶性前列腺疾病诊断及鉴别诊断中的应用价值。方法 :应用链霉亲和素生物素酶联免疫吸附试验 (SAB_ELISA)方法 ,检测50例前列腺增生 (BPH)、41例前列腺癌 (PCa)及11例前列腺炎患者血清T_PSA、F_PSA含量并计算F/T比值。结果 :F/T比值在前列腺增生和前列腺癌中有显著性差异(P<0.01) ,当T_PSA在4～10μg/L之间时 ,前列腺增生和前列腺癌患者中F/T比值呈现显著差异(P<0.01)。结论 :同时检测T_PSA和F_PSA ,计算F/T比值 ,可弥补在诊断前列腺疾病的传统检验中单纯测定T_PSA的不足 ,尤其对T_PSA在4～10μg/L之间的诊断“灰色区”

特应性皮炎和湿疹患者血清金黄色葡萄球菌肠毒素B特异性抗体的检测及其意义

目的探讨特应性皮炎(AD)和湿疹患者血清金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)特异性抗体水平及其意义。方法采用多中心、随机双盲、对照法,将118例AD和207例湿疹患者分为莫匹罗星治疗组和对照组,于治疗前和治疗28d取血清行间接酶联免疫吸附测定法测定抗SEB特异性IgG、IgM水平,采用链霉亲和素-生物素法检测抗SEBIgE水平。结果治疗前,抗SEBIgE水平AD组显著高于正常人对照组(P=0.019)和湿疹组(P=0.048),湿疹组与正常人对照组之间差异无统计学意义(P=0.883);抗SEBIgM水平AD组(P=0.012)和湿疹组(P=0.000)均显著高于正常人对照组,AD组与湿疹组之间差异无统计学意义(P=0.088);抗SEBIgG水平各组间均差异无统计学意义(P=0.897)。临床症状评分与抗SEBIgE水平之间AD组(P=0.842)和湿疹组(P=0.134)均无显著相关性。治疗28d后,抗SEBIgM水平AD组显著下降(P=0.003),湿疹组亦显著下降(P=0.000),但治疗组与对照组间AD组(P=0.331)和湿疹组(P=0.815)差异均无统计学意义。结论AD和湿疹患者血中抗SEBIgM、IgE升高,反映皮损处近期金黄色葡萄球菌定植并参与了皮肤变应性炎症性反应。

新型食物不耐受sIgG定量检测方法的构建

目的 以检测鸡蛋特异性免疫球蛋白G（sIgG）为例，探讨新型食物不耐受的定量检测方法。方法 选择行食物过敏原sIgG检测的患者173例，另择健康体检者78例为阴性对照。制备生物素化牛血清白蛋白-链酶亲和素酶标反应板，同时加入生物素化鸡蛋抗原和待检血清，洗涤后再加入酶标记抗人IgG，建立一种抗原间接包被-液相反应模式的酶联免疫方法；优化生物素化过敏原和酶标记抗体的浓度，确定反应条件。应用此方法检测血清标本中的sIgG。结果 选用生物素化蛋清作为抗原，其最适稀释比例是1∶2 000，酶标抗体的最适稀释比例是1∶12 000。此方法批内及批间变异系数分别为4.83%~8.55%,4.88%~7.93%；与蟹、牛奶、羊奶等的交叉反应率均〈10%；与临床现用食物不耐受sIgG检测法有较好的相关性（Y=0.977X＋8.45，r=0.961, P 〈 0.05）。结论 本检测方法可用于检测鸡蛋不耐受患者血清sIgG，操作简便，具有较高的准确性和特异度，重复性好，并显示较好灵活性潜能，为今后研制“个性化”随机组合食物品种的检测试剂盒奠定基础。

新生血管抑制剂VEGFR2-Fc的检测方法建立与方法学验证

目的建立重组人血管内皮生长因子受体Fc融合蛋白(VEGFR2-Fc)血药浓度的检测方法并进行验证,为该药物的动力学研究提供方法学。方法以羊抗人IgG-Fc作为捕获抗体,以生物素标记羊抗人VEGF R2为检测抗体,建立双抗夹心的BA-ELISA检测方法,并开展方法学试验。结果标准品的线性范围为28～0.4375ng/ml,相关系数达到0.999;质控浓度(20ng/ml、10ng/ml和5ng/ml)的回收率分别为103.159%、116.092%和102.528%,板内和板间精密度分别是8.87%、3.27%、15.41%和12.38%、7.97%、16.74%;灵敏度为0.25ng/ml。结论建立的BA-ELISA检测VEGFR2-Fc方法符合生物技术药物的方法学标准,可以用于体内药代动力学研究的分析方法。