链霉菌Streptomyces sp. FJS31-2次级代谢产物UK-78623的分离鉴定及抑菌活性研究

该研究对卤化II型聚酮类抗生素zunyimycins产生菌链霉菌(Streptomyces sp.)FJS31-2的次级代谢产物进行挖掘。次级代谢产物经乙酸乙酯萃取浓缩后,依次采用硅胶柱层析法、薄层层析(TLC)法、高效液相色谱(HPLC)法等方法进行分离和纯化,通过质谱(MS)法和核磁共振(NMR)等分析单体化合物的结构,并采用滤纸片法对其抗菌活性进行测试。结果表明,初次从该菌发酵物中分离得到多环内酯类化合物UK-78623,其对小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)具有明显抑制作用,其抑菌圈直径为25.2 mm。

梵净山土壤链霉菌Streptomyces sp.FJS 31-2生产的Ⅲ型聚酮类化合物

研究特殊生境梵净山土壤来源链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2次级代谢产物,为微生物药物开发提供结构复杂新颖物质来源,也为其衍生物的合成提供先导物。通过薄层层析、反复正(反)相硅胶柱层析等技术对Streptomyces sp.FJS31-2次级代谢产物纯化分离;利用质谱、核磁共振波谱技术进行结构鉴定。从Streptomyces sp.FJS31-2发酵产物分离得到3个化合物,结合质谱、核磁共振波谱技术进行结构解析,鉴定为2-(2'S-羟基丙基)-7-羟基色原酮(1)、Aloesone(2)和3,4-dihydro-3-(2-oxo-propyl)-3,6,8-trihydroxy-1(2H)-naphthalenone(3),都为III型聚酮类化合物。化合物1~3是首次从放线菌家族中分离鉴定得到天然产物。

苜蓿链霉菌TX21抑菌作用确定及促生物质的鉴定

链霉菌是一种重要的微生物资源,具有广泛的应用价值。本研究从土壤中筛选出一株对多种病原菌有抑制效果的菌株,编号TX21,其中对玉蜀黍平脐蠕孢的抑菌效果最优,为50.0%。采用浸种及喷施的方法探究了菌株TX21发酵上清液对水稻种子和黄瓜幼苗的促生效果,结果显示发酵上清液能使水稻种子胚根和胚芽分别增长48.5%和47.1%,黄瓜幼苗根系和鲜重分别增加了37.6%和47.0%,表现出良好的促生作用;通过形态学观察、生理生化和16S r RNA分子生物学鉴定苜蓿链霉菌Streptomyces alfalfae。利用黄瓜子叶叶绿素试验及UHPLC-MS方法明确了发酵上清液的有效促生物质,证实其中含有2-甲硫顺式玉米素核苷(ms^(2)io^(6)A,分子式:C_(16)H_(23)N_(5)O_(5)S)。

宁夏枸杞根际土壤链霉菌Ⅱ-2-2-2的基因组测序和次级代谢产物分析

目的 分析链霉菌Ⅱ-2-2-2基因序列,挖掘潜在次级代谢能力生物合成基因簇。方法 采用IlluminaHiSeq+PacBio测序技术获得链霉菌Ⅱ-2-2-2的基因组草图序列,经antiSMASH(v6.0.1)平台分析次级代谢产物合成基因簇,采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术对发酵液进行网络化分析。结果 自宁夏枸杞须根附近的土壤中分离得到一株菌株Ⅱ-2-2-2,经鉴定其与缺乏研究的Streptomycesacrimycini CSSP430 16S rRNA基因序列的相似度达99.64%。其基因组草图序列4 409 970 bp,G+C含量占66.43%,3974个蛋白质编码基因,10个rRNA操纵子和72个tRNA。Anti SMASH分析基因序列至少包含5条次级代谢产物合成基因簇,可能编码线性含唑肽类、核糖体合成和翻译后修饰的肽、非核糖体肽、聚酮类和萜类化合物。获得82个正负模式的离子,并将二级碎片离子在全球天然产物交互分子网络平台进行聚类分析和数据库搜索,发现了24个化学结构。结论 链霉菌Ⅱ-2-2-2具有丰富的次级代谢能力并可能成为研究和开发新抗生素的重要资源。

梵净山土壤来源链霉菌Streptomyces sp.FJS11-2次级代谢产物分析及抗菌活性研究

为了分析链霉菌Streptomyces sp. FJS11-2菌株次级代谢产物及次级代谢产物抗菌活性筛选,采用UPLC-DAD-HRMS方法对其次级代谢产物进行组分分析.用纸片扩散法对菌株次级代谢产物进行抗菌活性测试,测试菌株为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、粪肠球菌及布氏杆菌. UPLC-DAD-HRMS分析结果表明,该菌株含有多种未知代谢产物.且抗菌活性研究结果表明,该菌株代谢产物具有抗金黄色葡萄球菌、布氏杆菌活性. UPLC-DAD-HRMS分析结果及抗菌活性结果,为后续从该菌株次级代谢产物中发现活性良好、结构新颖的化学成分奠定基础,同时该方法也避免化学成分重复发现.

白刺链霉菌15-4-2中的抗MRSA活性成分研究

目的研究白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)15-4-2发酵液中的抗耐甲氧西林金葡菌(MRSA)活性成分。方法通过活性跟踪,采用柱层析等方法对白刺链霉菌15-4-2的次生代谢产物进行分离纯化。采用光谱分析对活性成分进行结构解析。结果分离鉴定了7个化合物,其结构分别为N-(2-羟基-1-(4-甲氧基苯基)乙基)乙酰胺(1)、2-(4-甲氧基苯基)-2-(丙胺基)乙醇(2)、cytoxazone(3)、对羟基苯甲酸(4)、(2S,3R)-3-羟基-2-甲基丁酸(5)、对甲基苯酚(6)和1,4-二甲氧基苯(7)。结论抗菌活性测试结果表明化合物1、3、4、5和6具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)活性。其中,1、3、4和5的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性为首次报道。

链霉菌182-2抗真菌活性物质的分离及抑菌特性的初步研究

[目的]链霉菌182-2的发酵液对烟草赤星病有良好的抑制作用,本文拟对其发酵液中抗真菌活性组分进行初步分离,并进行抑菌特性研究。[方法]发酵液经预处理后,依次用活性炭脱色,大孔树脂吸附层析分离纯化,对纯化后活性物质(组分Ⅱ)的抑菌活性进行测定。[结果]分离纯化结果表明其活性物质中至少含有两种抗真菌活性组分。离体条件下当活性物质浓度为2 000μg/mL时,对烟草赤星病菌有很强的抑菌作用,抑菌圈直径达58.0mm。目测法测定抗生作用表明其最小抑菌浓度(MIC)为80μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为160μg/mL。48h时对菌丝生长和孢子萌发的抑制率最高,抑菌中浓度(EC50)分别为31.9μg/mL和42.2μg/mL。活性组分处理还可导致病原菌菌丝和孢子萌发产生的芽管变形扭曲或产生大泡囊。[结论]纯化后的活性物质对烟草赤星病菌具有较强的抑制作用,有进一步研究利用的价值。

可可链霉菌182-2活性代谢产物对烟草赤星病菌的作用

【目的】明确可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)182-2的活性代谢产物——KA08对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的抑菌活性及其机理,为后续农用抗生素产品开发和应用提供科学依据。【方法】采用菌丝湿重法和培养皿中萌发法,测定KA08对烟草赤星病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用;采用电导率法和紫外吸收法测定其对细胞膜渗透性、麦角甾醇含量、脂质过氧化程度、可溶性蛋白含量的影响。【结果】KA08对烟草赤星病菌菌丝生长和孢子萌发均有强烈的抑制作用,同时,还可造成菌丝节间缩短、扭曲,芽管顶端膨大,并产生大量囊状膨大物。处理24 h时,对孢子萌发的抑菌中浓度为177.53μg·mL-1。抑菌机理研究发现KA08能导致菌丝体内电解质泄漏,细胞膜上麦角甾醇含量显著降低,脂质过氧化产物—丙二醛含量明显升高,并显著抑制菌丝体内蛋白质含量。【结论】农抗KA08对烟草赤星病菌具有显著抑制作用,主要通过抑制菌丝细胞膜上麦角甾醇合成,引发细胞膜脂质过氧化而使病菌细胞膜受损、通透性增加,从而导致菌丝生长受阻。细胞膜是KA08的主要作用位点之一。

链霉菌HNS2-2生物活性物质理化性质的初步研究

目的:初步研究链霉菌HNS2-2(StreptomyceteHNS2-2)生物活性物质的理化性质。方法:以金黄色葡萄球菌(Staphlo-coccus)为指示菌,以抑菌圈直径为指标,测定链霉菌HNS2-2发酵液经不同理化因子处理后的抑菌效果。结果:该菌株发酵液中生物活性物质对80℃以下处理20min不敏感,40～80℃时抑菌圈直径平均为14.6mm,而100～120℃为10.2mm;pH 4～6时抑菌圈直径最大为15.2mm;阳光光照影响较大,照射2h其抑菌圈直径比日光灯照组减小31%;可用乙酸乙酯等极性较大的溶剂萃取,能溶于水;Doskochilov八溶剂系统纸层析属于多烯类抗菌活性物质。结论:该菌株发酵液中生物活性物质具有良好的热稳定性、耐酸碱性、水溶性和强极性,经纸层析初步鉴定为多烯类抗菌活性物质。

龟裂链霉菌zwf2基因阻断提高土霉素生物合成

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是链霉菌磷酸戊糖途径中第一个酶("看家"酶),也是形成NADPH的关键酶,由zwf1和zwf2基因编码。以温敏型质粒pKC1139为基础构建了用于阻断龟裂链霉菌zwf2的重组质粒pKC1139-zwf2′,通过大肠杆菌GM2929去甲基化pKC1139-zwf2′后电转至原始龟裂链霉菌M4018感受态细胞,筛选得到转化子。转化子进一步通过PCR鉴定和点杂交印迹分析鉴定,证明是zwf2基因阻断的阳性突变子命名为M4018-Δzwf2。以原始菌株为对照,突变子摇瓶发酵结果表明:突变子的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活是原始菌的50%左右,但土霉素生物合成水平则提高了27%;在细胞生长方面,二者均在第4d进入生长稳定期而开始大量合成土霉素,发酵结束时细胞菌体浓度基本相同,但突变子的单位菌丝体土霉素生物合成能力则提高了31%。因此,zwf2的阻断有利于土霉素的生物合成,而对细胞生长没有明显影响。

链霉菌I06A-03304产生的二酮哌嗪类化合物的纯化及结构鉴定

目的分离鉴定链霉菌I06A-03304发酵液中具血管内皮细胞生长因子受体-2胞内酪氨酸激酶(VEGFR2-CD)抑制活性的次生代谢产物。方法采用大孔吸附树脂、羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)、C-18反相色谱(ODS)、高压液相色谱(HPLC)等分离手段对次生代谢产物进行分离纯化;通过二级质谱(ESI+-MS2)、紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振波谱(NMR)对其结构进行鉴定,以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测其次生代谢产物对VEGFR2-CD的抑制活性。结果分离得到两个二酮哌嗪类化合物:3304A和3304C;化合物3304A的化学结构与环(脯氨酸-亮氨酸)一致,化合物3304C的化学结构与环(脯氨酸-苯丙氨酸)一致,均对VEGFR2-CD表现出一定的抑制活性。结论化合物3304A和3304C是具有VEGFR2-CD抑制活性的二酮哌嗪类次生代谢产物,并为本研究首次报道。

2-脱氧链霉胺类抗生素生物合成基因的研究进展

含2-脱氧链霉胺类(2-DOS)氨基糖苷抗生素是临床常用抗生素。近几年对2-脱氧链霉胺类抗生素的分子水平研究取得重大进展,得到了2-DOS合成中的关键酶基因,以及丁酰苷菌素、妥布霉素、卡那霉素、庆大霉素等部分生物合成基因簇克隆。本文对2-脱氧链霉胺类抗生素生物合成基因研究进展进行了综述。

龟裂链霉菌zwf2基因敲入及阻断对土霉素合成的影响

目的考察敲入及阻断zwf2基因对6-磷酸葡糖脱氢酶(G6PDH)活性、细胞生长、土霉素合成的影响。方法构建敲入转化子M4018-(zwf2)和阻断转化子M4018-Δzwf2后,以原始菌株为对照,比较敲入转化子菌株M4018-(zwf2)和阻断转化子菌株M4018-Δzwf2摇瓶发酵后G6PDH活性、细胞生长、土霉素合成等生物性质的变化。结果阻断转化子菌株M4018-Δzwf2的G6PDH活性是原始菌的50%左右,敲入转化子菌株M4018-(zwf2)的G6PDH活性则略高于原始菌;阻断转化子菌株M4018-Δzwf2土霉素生物合成水平比原始菌提高27%,比敲入转化子菌株M4018-(zwf2)高约40%;发酵结束时敲入转化子菌株M4018-(zwf2)的细胞干重高于其他2株菌,其它2株菌的细胞干重差异不大。结论zwf2阻断有利于土霉素的生物合成,zwf2增强则对细胞生长有利。

链霉菌Sm4-1986对水稻纹枯病的防治效果

链霉菌Sm4-1986是中国科学院华南植物园植物病理研究组前期研究过程中获得的1株植物根际细菌,具有广谱抑菌特性。为了拓展水稻纹枯病的生防菌资源,测定了链霉菌Sm4-1986对水稻纹枯病菌生长的影响,采用离体叶片试验、无菌苗试验、盆栽试验以及大田试验,研究了链霉菌Sm4-1986对水稻纹枯病的防效,并分析了其代谢物对水稻纹枯病菌的抑制效果及对水稻的促生作用。结果表明,共培养条件下链霉菌Sm4-1986的代谢物与挥发物均能显著抑制立枯丝核菌菌丝生长,抑制率分别为67.31%与88.46%。叶片离体试验中,喷施链霉菌Sm4-1986后,水稻叶片纹枯病病害严重度较喷施无菌水处理下降87.50%;无菌苗试验、盆栽试验、大田试验中,接种病原菌5 d后,链霉菌Sm4-1986对水稻纹枯病的防效分别达100%、72.98%、60.35%。接种立枯丝核菌后,喷施链霉菌Sm4-1986发酵液的水稻叶片MDA含量较喷施清水处理降低48.06%。链霉菌Sm4-1986能够产生6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-PP),6-PP可以显著抑制立枯丝核菌菌丝生长,菌丝生长抑制率为50%、90%所需质量浓度(IC50、IC90)及最低杀菌浓度(MFC)分别是0.007 3、0.11、0.6 mg/mL;且6-PP可以显著促进水稻幼苗生长。可见,链霉菌Sm4-1986可以作为生物防治剂或者生物菌肥应用于水稻纹枯病防治。

海洋来源黄直丝链霉菌产物中新细胞周期抑制剂的研究

目的研究海洋来源黄直丝链霉菌Z4-007产物中的抗肿瘤活性成分。方法采用流式细胞术筛选模型与分离技术紧密结合的活性跟踪分离模式,以细胞周期抑制活性为抗肿瘤指标,分离纯化活性成分;根据理化常数及波谱数据鉴定化学结构;用流式细胞术测试化合物活性。结果从黄直丝链霉菌Z4-007发酵物中分离得到4个活性化合物,其中1个鉴定为1-(2,4-二羟基-3,5-二甲基苯基)-(2E,4E)-己二烯-1-酮(1),其余3个初步推测为环肽类化合物。用小鼠乳腺癌tsFT210细胞经用流式细胞术测试分析结果表明:化合物Ⅰ在高浓度时将细胞周期抑制在G0/G1期,而在低浓度时则抑制在G2/M期并显示出一定的细胞凋亡诱导活性。结论化合物Ⅰ为首次从链霉菌属的微生物产物中分离得到,是一个新的细胞周期抑制剂。

土壤放线菌P3-2的分类鉴定及抗菌活性研究

对从贵州土壤微生物中筛选到的放线菌菌株P3-2进行了分类学和抗菌活性的研究。采用多相分类法,对该菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性以及16S rDNA基因序列进行了研究。结果表明,放线菌P3-2菌株属于链霉菌属;16SrDNA序列长度为1 456 bp,序列分析和系统进化树分析表明其序列与Streptomyces recifenis ST100的同源性最高,为99.4%。但与S.recifenis ST100相比较,P3-2菌株的培养特征和生理生化特性中多项指标都存在着不同,初步确定菌株P3-2为链霉菌属中S.recifenis ST100的一个亚种,暂定名为Streptomyces sp.P3-2。P3-2菌株的10倍稀释发酵液对油菜菌核病菌、黄瓜灰霉病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌及半夏立枯病菌的抑制率高达99%,对烟灰霉病菌、玉米小斑病菌等9种病原真菌均有不同程度的抑制作用,对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制作用。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因—sanL的结构与功能

利用染色体步移策略 ,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针 ,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约 1 0kb的DNA片段。序列分析表明此片段中除含有sanK外 ,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框———sanL。sanL与sanK的转录方向相同 ,具有 1 2 81个核苷酸 ,起始密码子为 345位的ATG ,终止密码子为 1 62 3位的TGA。利用Blastx程序进行的分析揭示 ,此基因可能编码一个赖氨酸 2 氨基转移酶。基因功能研究表明 ,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的。

bcl-2、mtp53在Ⅰ型神经纤维瘤病中的表达及意义

目的了解bcl-2、突变型p53(mtp53)在Ⅰ型神经纤维瘤病(NF-Ⅰ)中的表达及意义,探讨它们在NF-Ⅰ中的作用。方法对9例孤立性神经纤维瘤、10例NF-Ⅰ及10例正常皮肤进行免疫组化(SP法)染色,观察bcl-2、mtp53在不同组织中的表达。结果bcl-2、mtp53在正常皮肤中均表达阴性。bcl-2在NF-Ⅰ中表达(100%)与孤立性神经纤维瘤(55·6%)之间的差异有统计学意义(P<0·01)。mpt53在NF-Ⅰ(70·0%)和孤立性神经纤维瘤(44·4%)之间的阳性表达差异无统计学意义,两者与正常皮肤之间的差异有统计学意义(P<0·01)。结论bcl-2、mtp53在NF-Ⅰ的发生及发展中起重要作用。推测bcl-2可能与细胞核膜上相应受体结合,并在其它多种细胞因子的作用下抑制瘤细胞的凋亡,造成肿瘤细胞生存延长,细胞数目增多而使瘤体持续的增大和复发。而在NF-Ⅰ中野生型p53(wild-type p53,wtp53)可能已突变成mtp53,从而转化细胞,抑制凋亡,加速肿瘤细胞生长。

Streptomyces yanglingensis KM-1-2遗传转化体系的建立及km790的过表达

杨凌链霉菌(Streptomyces yanglingensis)KM-1-2是从银杏种子中分离到的一株新菌,为对其次级代谢产物基因簇进行研究,需建立该菌株的遗传转化体系。通过接合转移的方法成功建立杨凌链霉菌KM-1-2的遗传转化体系,并确定最佳接合转移条件:以2CMY为接合转移培养基,孢子于50℃热激10 min,抗生素覆盖时间介于18~19 h,其中萘啶酮酸质量浓度为25 mg/L,安普霉素为3 mg/L,接合转移效率达1.052×10^-5。同时,利用该转化体系,过表达KM-1-2基因组中的1个SARP转录调控因子km790。与野生型链霉菌KM-1-2相比,过表达菌株Skm790生长速率加快,产孢时间提前,对部分病原真菌的拮抗性增强,而且代谢产物图谱发生明显变化。

用紫外线及2-脱氧-D-葡萄糖改良产土霉素菌

目的改善产土霉素菌的生产特性。方法紫外线诱变、在含有2-脱氧-D-葡萄糖的培养基中选育。结果紫外线照射30s的剂量下致死率适合做育种。在此基础上,诱变后选育出了一株高产菌株,编号9-15#,其摇瓶效价比原菌株提高了13.0%,上罐试生产提高6.1%。结论紫外线照射结合2-脱氧-D-葡萄糖的培养基中筛选可以获得高产土霉素的龟裂链霉菌菌种。