链霉菌GXT6中糖基水解酶1家族β-葡萄糖苷酶的性质研究

从实验室自行筛选到的链霉菌GXT6的基因组测序结果中找到一个编码β-葡萄糖苷酶的基因bgl2,对其编码的蛋白质序列进行生物信息学分析后发现是属于糖基水解酶1家族,不含有信号肽并具有较为明显的亲水性。利用PCR方法获得该基因,以p SE380为表达载体,成功构建重组质粒p SE-bgl2,转化至大肠杆菌XL1-blue中进行诱导表达,成功获得重组酶BGL2。利用镍亲和层析技术纯化重组酶,进一步进行酶学性质的研究。结果表明,重组酶BGL2的最适p H和最适温度为7.0和45℃,Km值为0.2871±0.01586 mmol·L^(-1),Vmax值为10.24±0.1577μmol·min^(-1)·mg^(-1)),葡萄糖抑制常数Ki值为75.63±5.499 mmol·L^(-1)。

链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及葡萄糖耐受性分子改造

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。