腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1,HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy,HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现,有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统,为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统,本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒,筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子,筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后,我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region,LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)的AAV6递送载体系统,感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya,T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除,流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-1 LTR的ZFN能介导从细胞基因组中切除HIV-1前病毒基因组。实验证明,6型重组腺相关病毒递送靶向HIV-1 LTR的ZFN能有效切除HIV-1前病毒基因组,为该系统未来的体内应用奠定了基础。

人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术

锌指核酸酶(ZFN)由锌指蛋白(ZFP)结构域和Fok I核酸内切酶的切割结构域人工融合而成,是近年来发展起来的一种可用于基因组定点改造的分子工具。ZFN可识别并结合特定的DNA序列,并通过切割这一序列的特定位点造成DNA的双链断裂(DSB)。在此基础上,人们可以对基因组的特定位点进行各种遗传操作,包括基因打靶、基因定点插入、基因修复等,从而能够方便快捷地对基因组实现靶向遗传修饰。这种新的基因组定点修饰方法的突出优势是适用性好,对物种没有选择性,并且可以在细胞和个体水平进行遗传操作。文章综述了ZFN技术的研究进展及应用前景,重点介绍ZFN的结构与作用机制、现有的靶点评估及锌指蛋白库的构建与筛选方法、基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,为开展这一领域的研究工作提供参考。

锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞

敲除猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因可能提高猪瘦肉率,MSTN基因敲除猪也可作为相关疾病的动物模型。文章利用锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)技术敲除五指山小型猪胎儿成纤维细胞MSTN基因,为制备MSTN基因敲除猪奠定基础。ZFNs质粒或编码ZFNs的mRNA均能高效敲除MSTN基因,使用ZFNs mRNA能直接得到MSTN+/-和MSTN-/-两种基因型的细胞克隆。DNA序列测定与分析发现,细胞克隆的突变类型多为ZFNs作用靶位点处不大于10 bp的碱基插入或缺失(92.18%);氨基酸预测发现,突变型MSTN基因的终止密码子常常提前出现。将MSTN基因敲除的细胞进行体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)发现,胚胎体外早期发育潜力与野生型无显著差异,表明这些细胞可用于后续MSTN基因敲除猪的制备。

锌指核酸酶在基因组靶向修饰中的应用

同源重组和逆转录病毒介导转基因法是目前基因组修饰中常用的两种主要方法.由于这些传统方法效率低,特异性差等缺点,制约了其在研究中的应用.锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)是一种人工合成酶,含有锌指蛋白DNA结合域和非特异性核酸酶FokI结构域.ZFN在对基因组的靶向修饰时,表现出高度特异性和高效性.最新研究结果显示,锌指核酸酶在哺乳动物细胞和斑马鱼基因组靶向敲除的效率高达20%.这一技术的出现,将给基因组靶向修饰的研究和应用领域带来革命,特别是在基因治疗人类疾病方面有巨大的潜力和广阔的前景.

靶向绵羊MSTN基因的锌指核酸酶腺病毒表达载体的构建及活性验证

旨在构建并包装打靶绵羊MSTN基因的位点特异性锌指核酸酶腺病毒表达载体,以借助腺病毒的高转染效率和非整合性以及锌指核酸酶的高效性和特异性实现对绵羊MSTN基因的敲除。本研究利用PCR扩增T2A序列和锌指核酸酶异源二聚体序列,测序鉴定后依次克隆至pAdTrack-CMV,得到pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR穿梭载体,将之与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转染至BJ5183菌株进行同源重组,以构建pAdEasy-ZFNL-T2A-ZFNR表达载体。然后用上述表达载体转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装,将PCR鉴定阳性的病毒进行扩增并测定病毒滴度。侵染绵羊胎儿成纤维细胞检测重组腺病毒对靶细胞的侵染能力,并用Western blot方法检测绵羊胎儿成纤维细胞中ZFN的表达,进而在细胞水平验证ZFN的活性。结果,包装得到的锌指核酸酶重组腺病毒能够高效侵染绵羊胎儿成纤维细胞并表达ZFN,腺病毒介导的ZFN可识别并切割绵羊MSTN基因。本研究成功获得靶向识别并切割绵羊MSTN基因的锌指核酸酶重组腺病毒。

锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用

锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)具有特异性识别并敲除DNA片段中特定基因的特点,通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞,是能够应用于动物转基因上的一种新技术。该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果,相对于传统的转基因技术,该技术在简化操作程序、缩短操作时间及提升成功率上都有很大的提高。就常用的动物转基因方法、锌指核酸酶技术的作用原理以及在动物转基因上的应用及其前景进行了论述。

锌指核酸酶技术在动物转基因研究中的应用

锌指蛋白核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)是一种人工合成酶,含有锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域,因其能特异性识别并切割DNA序列及其可设计性而被用基因定点突变和外源基因定点整合。这项技术已应用于转基因动物研究中。本文综述了锌指核酸酶技术在转基因研究中的应用进展,并对锌指核酸酶技术的应用前景进行了展望。

锌指核酸酶技术在动物转基因中的研究进展

锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)技术是近年来发展起来的一种基因修饰技术,利用ZFNs可特异识别靶位点DNA序列并使其断裂。与传统基于同源重组的基因打靶相比,ZFNs能使打靶效率提高100000倍,并使基因断裂与突变修复达到同样效果。ZFNs已经应用于多种生物,包括昆虫、两栖类生物、线虫、植物、多种动物和人类细胞。这些应用提高了人们对复杂生理系统的理解,使ZFNs成为一种生产转基因动物、细胞系和植物的有力工具,并在治疗人类疾病中发挥重要作用。文章对ZFNs技术原理及其应用于哺乳类动物转基因的研究进行了回顾和展望。

人工锌指核酸酶的电子设计与结构模拟

以电子设计用于猪的多位点基因打靶的人工锌指核酸酶为例,探索如何电子设计优化理想的人工锌指核酸酶,以减少人工锌指核酸酶的毒性。采用OPEN电子设计方法,生物信息学方法的预测分析ZFP的立体结构,设计优化合适的连接体和间隔体组合,并通过突变优化Fok I异源二聚体。采用OPEN法设计三指ZF序列,并连接为ZFP序列,设计出长度为6 bp且富含AT碱基的spacer,加上长度为4个氨基酸残基的inter-domain linker,连接FokⅠ切割结构域双突变子异源二聚体,并通过各种软件工具对ZFN的空间结构进行模拟预测,所设计得到的ZFN的有效率超过50%。探索获得电子设计理想ZFN的方案,即特异性结合DNA的锌指蛋白、最佳的linker和spacer的长度与组合以及优化的特异性切割的Fok I异源二聚体切割结构域。

基于GFP的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证

旨在构建基于GFP报告基因的ZFN真核细胞筛选体系,为ZFN的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法。以pEGFP-N1为基础,去除EGFP基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通用载体pEGFP-ATG。将ZFN的靶序列插入到通用载体EGFP基因上游,且使起始密码子和EGFP基因处于不同ORF中,构建筛选载体pEGFP-728。将pEGFP-728转入Hela细胞中,G418筛选Hela-728细胞系,转染ZFN到Hela-728,48h内通过观察荧光判断ZFN是否有效,挑取荧光细胞进行PCR、测序验证靶序列的敲除。测序分析表明,通用载体pEGFP-ATG和含靶序列的筛选载体pEGFP-728序列完全正确;pEGFP-728转入Hela细胞中观察不到绿色荧光,说明靶序列插入后使EGFP发生移框;转染靶序列对应的ZFN到Hela-728中,48h观察到荧光的表达,说明ZFN有效;挑取6个荧光细胞单克隆,PCR、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变。锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功。相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏,更适用于动植物等真核细胞的ZFN筛选,同时还可应用于TALEN和CAS9的筛选。

锌指核酸酶及其应用研究进展

锌指核酸酶由锌指和非限制性切割酶两部分组成,锌指能特异性结合基因组双链DNA,非限制性切割酶能造成染色体上双链DNA的断裂,通过机体的修复机制可以使目的基因突变或外源基因插入,进而应用于转基因动物的制备。综述了锌指、切割酶及采用锌指核酸酶制备转基因动物的研究进展,主要包括锌指的发现、结构及与DNA结合时的碱基分布和结合方式,锌指的筛选和设计方法;切割酶的研究进展包括FokⅠ的发现及切割特点,基因修饰后的异源二聚体切割特异性等。

猪CFTR基因特异性锌指核酸酶的筛选与鉴定

【目的】获得靶向猪囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regu-lator,CFTR)基因的特异锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN),为建立CFTR基因敲除猪细胞系提供技术支持。【方法】通过开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选,首先以已知三锌指蛋白为框架,随机突变单个锌指关键位点氨基酸编码序列,建立人工三锌指蛋白随机库;然后应用细菌双杂交技术,从库中筛选出能够结合CFTR基因靶位点的三锌指蛋白;最后将获得的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ组装成特异ZFN,通过酵母验证体系,检测ZFN靶向切割其识别序列的效率。【结果】获得3个人工三锌指蛋白随机库,每个库约含有2×106个单克隆,通过2轮细菌双杂交筛选,分别获得48个针对CFTR基因左右两侧靶位点的三锌指蛋白。ZFN活性验证结果表明,约90%的ZFN能够在酵母细胞内实现靶向切割,获得了高效特异的ZFN。【结论】获得了猪CFTR基因高效特异的ZFN。

锌指核酸酶在基因组编辑中的应用

基因组编辑是建立在基因靶向修饰的基础上,对生物基因组进行改造的一项新技术。锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)是一种特异性强、应用范围广的人工合成酶,可在靶位点制造DNA双链切口(double-strand break,DSB)进而诱导细胞内源性修复机制,通过同源重组修复(homology-directed repair,HDR)或非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径实现基因替换和纠正,因而成为基因组编辑的良好工具。本文将就最近文献中提到的锌指核酸酶在基因组编辑中的应用做一综述。

人工锌指蛋白随机库的构建及其在锌指核酸酶筛选中的应用

利用开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选具有较高特异性和亲和性的锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP)。以已知三锌指蛋白为框架,使单个锌指关键位点氨基酸编码序列产生随机突变,构建3个人工锌指蛋白随机库,建立和完善应用人工锌指蛋白随机库筛选特异性锌指蛋白的技术平台。以人DYRK1A基因为例,测试和验证该技术平台的可行性和效率,分别获得对DYRK1A基因靶序列中左侧和右侧位点具有较高亲和性的50个三锌指蛋白;然后将得到的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ连接,构建DYRK1A锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN),应用酵母验证系统测试DYRK1A锌指核酸酶的活性,结果表明,90%的组装锌指核酸酶能够在靶位点进行切割。

锌指核酸酶技术在基因治疗中的应用研究进展

锌指核酸酶技术是一种新兴的基因高效靶向修饰和调控技术,目前该技术已在人类疾病的基因治疗中得到应用,通过敲除致病基因使其丧失致病性或者通过修复突变基因使基因表达正常,实现了对多种人类疾病的基因治疗。基于提高锌指核酸酶效率、特异性和降低细胞毒性等方面的研究较少的现状,特就人工锌指核酸酶介导的基因敲除和基因同源重组修复等在人类疾病基因治疗方面的应用及存在问题进行了综述,并对相关研究的开展进行了展望。

锌指核酸酶技术研究进展

重组锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)是锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白,可切割特异DNA序列,引起DNA双链断裂(double strand break,DSB),提高了依赖同源重组完成特定基因改造和修饰等的基因打靶的效率,为转基因及基因治疗研究提供了更有效的技术平台。论文对ZFN及其应用研究状况进行了回顾和展望。

锌指核酸酶技术最新进展及其在植物基因工程中的应用

锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)是近年来发展起来的一项定点改变基因组序列的新技术.它能够特异切开基因组中的特定序列,产生双链断裂DNA,诱导细胞启动DNA损伤修复过程,在修复过程中实现对靶基因的敲除或改变.这一技术可以通过删除某一基因或一个基因的一部分、导入点突变等,对该基因的功能进行研究,也可以定向改变基因组序列,使生物体获得新的功能.这项技术在基因功能的研究和新药的研发、新品种选育等方面有着十分广阔的应用前景,是后基因组时代基因功能研究的重要手段.介绍了ZFNs工作原理,重点阐述了该技术近几年的最新进展及其在植物学领域的应用,同时也对ZFNs存在的问题进行了深入分析.

利用锌指核酸酶对猪基因组进行定向遗传修饰

人工锌指核酸(zinc finger nucleases,ZFN)在植物和动物细胞中可以有效提高DNA修饰的效率和特异性使它很快就成为当前的一个研究热点。ZFN可使DNA双链断裂,然后依靠细胞中复杂的DNA修复机制修饰特定的基因。本文主要介绍ZFN在生产转基因猪研究中的应用及其未来的应用前景。目前采用传统的基因打靶和体细胞核移植的方法,科学家们已经获得了一批基因敲除猪。然而采用传统的基因打靶技术对哺乳动物体细胞进行遗传修效率较低,而且位点特异性和外源DNA整合效率都难以控制。ZFN能够结合到DNA特定位点上,并产生切割作用,使基因打靶的效率提高了几个数量级。本文将详细介绍目前应用ZFN技术获得基因敲除猪模型的几项研究,以及应用ZFN技术加快生产可用于农业生产和生物医药研究的转基因猪。文中还将讨论ZFN在猪的基因组遗传修饰中的安全性和有效性,以及ZFN技术在生猪产业中的创新性应用。

锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用探究

随着时代的进步和科学技术的发展，我国转基因技术得到了迅速发展，目前出现了一种锌指核酶算技术，这种技术除了特异性识别之外，还可以将DNA片段中特定基因给敲除掉，通过靶向修饰DNA片段上的特定基因，促使新型细胞的出现。本文简要分析了锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用，希望可以提供一些有价值的参考意见。

锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶

该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.