基于癌症基因组图集数据库分析锌指蛋白580 mRNA在肝细胞癌中的表达及意义

目的研究锌指蛋白580(ZNF580)mRNA在肝细胞癌中的表达以及临床价值,预测ZNF580mRNA在肝细胞癌发生发展中的作用。方法从癌症基因组图集(TCGA)数据库下载肝细胞癌数据集,获得ZNF580mRNA基因表达谱和临床信息。利用相关生物信息学方法,分析ZNF580mRNA在肝细胞癌中表达的情况与临床病理指标的相关性以及对预后的影响。用基因富集化分析预测ZNF580mRNA在肝细胞癌中调控的可能通路。计量资料2组间比较采用t检验,计数资料组间比较采用χ^2检验,并运用Cox比例风险回归模型分析影响患者预后的危险因素,计算风险比(HR)及95%可信区间(95%CI)。结果在TCGA数据库中,ZNF580mRNA的表达水平在肝癌组织中明显高于癌旁组织(8.440±0.705vs7.736±0.387,P<0.05),其表达水平在不同肿瘤分级的患者中差异有统计学意义(t=-2.068,P<0.05)。ZNF580mRNA高表达患者的总体生存期明显低于ZNF580mRNA低表达患者(χ^2=5.456,P<0.05)。多因素Cox回归分析提示ZNF580mRNA的表达水平[HR(95%CI):1.600(1.079~2.372)]和TNM分期[HR(95%CI):2.006(1.394~2.888)]是影响肝细胞癌患者总体生存期的独立危险因素(P值均<0.05)。ZNF580mRNA高表达的样本存在核糖体、亨廷顿病两个通路基因集的富集(P值均<0.05,错误发现率分别为0.198、0.243)。结论ZNF580mRNA可能作为促癌基因在肝细胞癌中发挥作用,有望成为判断肝细胞癌预后的指标和潜在的新治疗靶点。

大鼠锌指蛋白ZFP580的原核表达与分离纯化

【目的】构建ZFP580基因的原核表达质粒,转化大肠杆菌,诱导表达并分离纯化大鼠锌指蛋白ZFP580。【方法】根据ZFP580 cDNA序列的开放阅读框设计引物,利用PCR技术扩增ZFP580的开放阅读框cDNA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,Nco I、Xho I双酶切电泳筛选、鉴定并测序。将构建的重组质粒pET30a-ZFP580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白。【结果】成功扩增ZFP580基因并构建了表达质粒pET30a-ZFP580,测序结果表明与GeneBank公布的序列一致。含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa。【结论】成功表达并纯化了大鼠ZFP580蛋白,为进一步研究锌指蛋白ZFP580的功能奠定了基础。

大鼠心肌缺血-再灌注损伤中转录因子ZFP580表达的变化

目的:研究核转录因子锌指蛋白580(ZFP580)在大鼠心肌缺血-再灌注(I-R)损伤中表达的变化,探讨其可能的作用。方法:48只SD大鼠分为:(1)假手术组;(2)I-R组,结扎冠状动脉左前降支30 min后恢复血液灌注;(3)L-精氨酸(L-Arg)预处理+I-R组,于缺血前给予L-Arg 300 mg/kg,重复I-R组操作;(4)L-Arg预处理+sham组。(2)、(3)组于I-R后1 h或4 h处死动物。各组大鼠取心肌标本HE染色,光镜下计数心肌组织中中性粒细胞数。检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度,半定量RT-PCR或免疫组化染色分析ZFP580及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在心肌细胞的表达。结果:I-R后,缺血区心肌细胞肿胀,周围大量中性粒细胞浸润,血清LDH、CK活性及TNF-α浓度升高,心肌ZFP580和eNOS表达下调(P<0.05)。应用L-Arg预处理+I-R后,血清LDH、CK活性及TNF-α浓度降低,心肌ZFP580和eNOS的表达回升。结论:心肌I-R损伤引起ZFP580表达下调。ZFP580及eNOS的表达上调可能是L-Arg预处理拮抗心肌I-R损伤的机制之一。

H_2O_2诱导的氧化应激对锌指蛋白ZNF580表达的影响

【目的】研究过氧化氢(H_2O_2)对EA.hy926内皮细胞锌指蛋白580(zinc finger 580,ZNF580)表达的影响。【方法】先以不同浓度H_2O_2作用内皮细胞EA.hy926,测定细胞上清中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)确定细胞的损伤程度。选择适宜的H_2O_2浓度作用细胞,在不同浓度和不同时间点提取总RNA和蛋白,以RT-PCR检测ZNF580的m RNA表达水平,同时western blotting检测其蛋白表达差异。【结果】随着H_2O_2浓度的升高,LDH释放随之升高,不同浓度H_2O_2作用EA.hy926内皮细胞后,ZNF580在m RNA转录水平和蛋白水平的表达均有增加,并呈现浓度依赖的趋势。同样的浓度为100μmol/L的H_2O_2作用EA.hy926内皮细胞不同时间后,检测可知ZNF580 m RNA和蛋白水平的表达增加,与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】一定浓度和时间的外源性H_2O_2作用内皮细胞可促进ZNF580在一定程度表达上调。

人ZNF580基因的原核表达及单克隆抗体的制备

【目的】原核表达纯化人锌指蛋白(zinc finger protein 580,ZNF580)并制备抗人ZNF580单克隆抗体。【方法】将构建的重组质粒pET30a-ZNF580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl beta-D-galactosidase,IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备针对ZNF580的特异性单克隆抗体并通过ELISA和Western blotting方法鉴定。【结果】含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa,通过将Sp2/0细胞与免疫鼠的脾细胞融合获得了1株能稳定表达ZNF580抗体的杂交瘤细胞株(H4E4C5),其分泌的单克隆抗体的IgG亚类IgG2b,ELISA检测腹水抗体效价为1:1.28×10~5,Western blotting结果显示抗ZNF580单克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本实验成功表达并纯化了ZNF580蛋白并制备了抗ZNF580蛋白的单克隆抗体,为进一步研究锌指蛋白ZNF580的功能奠定了基础。